恩諾沙星在大口黑鱸(Micropterus salmoides)體內(nèi)代謝動力學(xué)研究

何 欣，王 揚，貝亦江

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 實驗中心，浙江 杭州 310024；2.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310012)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，俗稱加州鱸魚，隸屬鱸形目(Perciformes)鱸亞目(Porcoidei)太陽魚科(Cehtrachidae)黑鱸屬(Micropterus)。自20世紀(jì)80年代初由北美引進后，因其肌肉營養(yǎng)價值豐富全面、味道鮮美可口、生長快、易起捕，現(xiàn)已推廣到全國各地，成為我國新的重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。然而，由于大口黑鱸引進時主要由野生種馴化而成，經(jīng)多年近親繁育和集約化養(yǎng)殖，種質(zhì)退化和抗病能力降低等問題日漸突出。

養(yǎng)殖過程中抗生素的不合理使用是影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全的主要因素。目前國內(nèi)外對用抗生素治療大口黑鱸疾病的研究報道較少，尤其是關(guān)于抗生素在大口黑鱸體內(nèi)代謝殘留的研究極少。因此，很有必要開展抗生素在大口黑鱸體內(nèi)的代謝研究。

恩諾沙星是一種動物專用的廣譜喹諾酮類抗菌藥物，在原農(nóng)業(yè)部235號公告中被作為許可用藥，在牛、羊肌肉中最高殘留限量為0.1 mg·kg-1[1]。恩諾沙星口服吸收好，血藥濃度高且穩(wěn)定，能廣泛分布于組織中，其代謝產(chǎn)物為環(huán)丙沙星，仍有強大抗菌作用。恩諾沙星對水生動物常見的病原菌，如嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[2]、愛德華氏菌屬(Edwardsiellatarda)[3]、摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii)[3]等的抗菌活性均較強，對由耐藥性致病菌引起的嚴(yán)重感染有效，與其他抗菌素?zé)o交叉耐藥性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于大口黑鱸養(yǎng)殖過程中，如治療遲緩愛德華氏菌病等[4]。

本研究采用口服連續(xù)給藥的方式，研究大口黑鱸血漿、肌肉和肝臟中恩諾沙星的代謝動力學(xué)，以期為明確恩諾沙星在大口黑鱸養(yǎng)殖中的合理用藥及休藥期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物與主要試劑

恩諾沙星原粉，濃度≥98%，河北大山動物藥業(yè)有限公司；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%，Sigma公司；超純水，采用MILL-Q超純水儀制備，符合GB/T 6682—2008一級水的標(biāo)準(zhǔn)；甲醇、正己烷均為色譜純，Sigma公司；無水硫酸鈉，分析純，經(jīng)高溫灼燒4 h后，置于密閉容器中備用；酸化乙腈，鹽酸-水-乙腈體積比1∶1∶250配制；肝素鈉，上海哈靈生物科技有限公司；三乙胺，阿拉丁試劑；磷酸，濃度≥99%，Sigma公司。

1.2 主要儀器

Waters Acquity UPLC型高效液相色譜儀，配有熒光檢測器(FLR)，Waters公司；HY-4A型振蕩器，常州澳華儀器有限公司；IKA MS3 digital型渦旋混合器，德國艾卡公司；KQ3200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Fulgor TDL-5A型高速離心機，德國菲恰爾公司；OA-SYS N-EVAP 112型氮吹儀，美國Organomation公司；IKA T18 Basic型高速組織搗碎機，德國艾卡公司。

1.3 實驗動物

健康大口黑鱸，80尾，體質(zhì)量(205±40)g，采自浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站的外塘(40 m×60 m)，體態(tài)正常，無明顯外傷。經(jīng)隨機抽取檢測，大口黑鱸體內(nèi)未檢出恩諾沙星。實驗前，在溫室大棚[30 m×50 m，氣溫(26±1)℃]的水池[5 m×3 m，水溫(25±2)℃]中馴養(yǎng)7 d。馴養(yǎng)期間投喂不含恩諾沙星的普通飼料。

1.4 給藥方式與劑量

將6 g恩諾沙星原粉(濃度不小于98.5%)用水溶解后，添加6 g飼料黏合劑，與10 kg飼料拌勻，陰暗處晾干。連續(xù)投喂給藥5 d，每天的投喂量為魚體質(zhì)量的5%，相當(dāng)于每尾大口黑鱸恩諾沙星30 mg·kg-1(以體質(zhì)量計)的劑量。大口黑鱸每次攝食1～2 h，每次攝食結(jié)束后清理池塘，確保沒有任何飼料懸浮。

1.5 采樣時間與樣品保存

采樣時間點分別為給藥后1、2、4、8、12、24、48、72、120、168、240、360 h。每個時間點隨機采集6尾實驗大口黑鱸，頭胸部之間取血至少2 mL至肝素鈉處理過的塑料離心管中，分離血漿。去鱗、去皮，沿脊背取肌肉，肌肉樣品切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊后，置于研磨機中研磨均勻。另取肝臟樣品置于研磨機中研磨均勻。每一尾大口黑鱸的每個組織、血漿均單獨制樣，樣品置-20 ℃冰箱保存，待測。

1.6 組織中恩諾沙星濃度測定方法

1.6.1 前處理方法

前處理方法參照《農(nóng)業(yè)部(原)783號公告—2—2006 水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測定 液相色譜法》，并作適當(dāng)修改，具體如下：準(zhǔn)確稱取(1.00±0.01)g的樣品于50 mL塑料離心管中，依次加入6 g無水硫酸鈉和30 mL酸化乙腈，渦旋2 min混勻，將樣品置于三角瓶中，搖床振蕩20 min，再轉(zhuǎn)入高速離心機中，相對離心力6 000g，離心10 min，去上清液重復(fù)提取一次，合并上清液，加入25 mL正己烷，振蕩5 min，取乙腈層，旋轉(zhuǎn)蒸干，用1.0 mL流動相溶解殘渣，移入1.5 mL離心管中，相對離心力5 500g，離心5 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后待測。

1.6.2 色譜條件

流動相：0.05 mol·L-1磷酸三乙胺溶液-乙腈，體積比9∶1；檢測器FLR；激發(fā)波長280 nm；發(fā)射波長450 nm；流速0.4 mL·min-1；色譜柱為Waters BEH C18柱，2.1 mm×100 mm(1.7 μm)；柱溫40.0 ℃；流動相A為磷酸水溶液(0.01 mol·L-1)，流動相B為乙腈；流動相A、B比例為88∶12(體積比例)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用3P97藥動學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，制作藥時曲線圖，擬合藥動學(xué)房室模型，計算藥動學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 恩諾沙星的色譜圖

按照1.6節(jié)色譜條件，恩諾沙星保留時間為3.573 min，如圖1所示。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與定量限

移取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μg·mL-1的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，按儀器工作條件進行測定。在0.05～5.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，恩諾沙星濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，定量限(信噪比>10)為0.05 μg·mL-1。

2.1.3 加標(biāo)回收率

在大口黑鱸空白血漿、肌肉和肝臟中加入不同濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，如表1所示，平均加標(biāo)回收率為70.3%～85.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.49%～8.57%，符合檢測要求。

2.2 藥時曲線分析

經(jīng)過測定，每個時間點大口黑鱸血漿、肌肉、肝臟中恩諾沙星的濃度如表2所示，選取0～120 h作藥時曲線(圖2)。大口黑鱸血液中恩諾沙星濃度從1 h的7.740 μg·mL-1上升到4 h的峰值12.12 μg·mL-1，隨后開始下降，至240 h仍能檢測出0.065 μg·mL-1的殘留量，從360 h起，未檢出或檢出含量低于檢出限。肌肉中恩諾沙星濃度從1 h的12.18 μg·g-1下降到2 h的8.895 μg·g-1，隨后上升，4 h達到峰值15.22 μg·g-1，之后一直下降，直至360 h仍能檢測出0.079 μg·g-1的殘留量。大口黑鱸肝臟中恩諾沙星濃度從1 h開始就迅速上升，至4 h達到峰值15.89 μg·g-1，隨后開始下降，直至360 h仍能檢測出0.170 μg·g-1的殘留量。

圖1 1 μg·mL-1恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of 1 μg·mL-1 enrofloxacin

表1大口黑鱸各組織中加標(biāo)不同濃度恩諾沙星的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

Table1Recovery rate and relative standard deviation of enrofloxacin in different tissues of largemouth bass(n=6)

加標(biāo)濃度Spiked levels/(μg·mL-1)血漿Plasma加標(biāo)回收率Recovery rate/%相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%肝臟Liver加標(biāo)回收率Recovery rate/%相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%肌肉Muscle加標(biāo)回收率Recovery rate/%相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%0.176.56.4483.98.5779.52.490.575.16.1785.86.4375.46.991.070.34.3880.17.1377.45.075.078.86.0271.23.2277.26.48

2.3 藥動學(xué)參數(shù)

投喂恩諾沙星后，大口黑鱸血漿、肌肉和肝臟中的恩諾沙星呈一室開放模型，藥動學(xué)參數(shù)如表3所示，動力學(xué)方程如下：

C血液=6.889×(e-0.07511t-e-0.6390t)；

C肌肉=7.510×(e-0.02676t-e-0.2931t)；

C肝臟=5.332×(e-0.01700t-e-0.3372t)。

2.4 恩諾沙星在大口黑鱸體內(nèi)的吸收與代謝殘留

吸收半衰期[T1/2(Ka)]是衡量藥物吸收速率的重要參數(shù)。研究顯示，恩諾沙星在多種暖水性魚類中的吸收均較快：(25±2)℃下，在眼斑擬石首魚血漿中的吸收半衰期為0.477 h[5]；18 ℃下，在黑鲪肌肉和血液中的吸收半衰期分別為2.015 h和2.173 h[6]；24～26 ℃下，異育銀鯽血液、肌肉和肝臟中的吸收半衰期分別為2.92、14.03、8.55 h[7]。恩諾沙星在冷水性魚類中的吸收較慢：23～25 ℃下，歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)血漿、肌肉和肝臟中的吸收半衰期分別為11.28、56.39、51.82 h[8]；(20±1)℃下，雜交鱘血液、肌肉和肝臟中的吸收半衰期分別為6.861、3.794、44.88 h[9]。消除半衰期是血漿藥物濃度下降一半所需要的時間，其長短可反映體內(nèi)藥物消除速度。目前，關(guān)于恩諾沙星在水產(chǎn)動物體內(nèi)的消除半衰期已有較多報道，結(jié)果顯示，消除半衰期受種屬及水溫影響極大。

表2給藥后不同時間大口黑鱸各組織中恩諾沙星的濃度和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

Table2Concentrations and relative standard deviations of enrofloxacin in different tissues of largemouth bass (n=6)

t/h血漿Plasma濃度Concentration/(μg·mL-1)RSD/%肝臟Liver濃度Concentration/(μg·mL-1)RSD/%肌肉Muscle濃度Concentration/(μg·g-1)RSD/%17.74011.345.4289.3612.1814.2228.0887.6211.569.238.89510.45412.124.6515.8910.6215.227.2184.3148.1313.1314.5610.3910.39123.79915.897.97813.908.30913.58242.12332.785.90522.397.00128.09482.02125.182.54131.084.87429.67721.4008.312.4176.382.59211.71960.58215.401.83213.421.24417.381200.23612.550.90815.780.7579.231680.09517.320.5827.750.43014.902400.0657.510.2437.560.1918.02360000.17012.330.0795.80

圖2 恩諾沙星在大口黑鱸體內(nèi)的藥時曲線Fig.2 Concentration-time curve of enrofloxacin in largemouth bass

如表3所示：本研究中連續(xù)5 d投喂30 mg·kg-1劑量的恩諾沙星后，恩諾沙星在大口黑鱸血漿、肌肉和肝臟組織中的吸收半衰期分別為0.998、2.176、1.892 h，消除半衰期分別為8.494、23.84、37.53 h，血液中的藥時曲線下總面積為132.23 μg·mL-1·h，肌肉和肝臟中的藥時曲線下總面積分別為273.50、247.12 μg·g-1·h。血液中表觀清除率為0.018 89 μg·mL-1·h-1·(μg·mL-1)-1，肌肉、肝臟中表觀清除率分別為0.013 12、0.017 81 μg·g-1·h-1·(μg·g-1)-1。血液中的中央室表觀分布容積為1.893 0 μg·mL-1·(μg·mL-1)-1，肌肉和肝臟組織中的中央室表觀分布容積為1.0842、2.9329 μg·g-1·(μg·g-1)-1。恩諾沙星在大口黑鱸血漿、肌肉和肝臟組織中的達峰時間均為4 h，對應(yīng)的峰值濃度分別為12.12 μg·mL-1、15.22 μg·g-1和15.89 μg·g-1，表明恩諾沙星在大口黑鱸體內(nèi)的吸收與代謝速率均較快。

表3恩諾沙星在大口黑鱸各組織中的藥動學(xué)參數(shù)

Table3Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in different tissues of largemouth bass (n=6)

參數(shù) Parameter單位Unit血漿Plasma肝臟Liver肌肉MuscleAμg·mL-1 [μg·g-1]6.8895.3327.510Keh-10.075110.017000.02676Kah-10.63900.33720.2931T1/2(Ka)h0.9981.8922.176T1/2(Ke)h8.49437.5323.84AUCμg·mL-1·h [μg·g-1·h]132.23247.12273.50CL/F(s)μg·mL-1·h-1·(μg·mL-1)-1 [μg·g-1·h-1·(μg·g-1)-1]0.018890.017810.01312V/F(c)(μg·mL-1) ·(μg·mL-1)-1 [(μg·g-1) ·(μg·g-1)-1]1.89302.93291.0842T(Peak)h444

單位中不加[ ]的是血漿中的單位，加[ ]的是肝臟和肌肉中的單位。A為分布相的零時截距；Ka為吸收速率常數(shù)；Ke為消除速率常數(shù)；T1/2(Ka)為吸收半衰期；T1/2(Ke)為消除半衰期；T(Peak)為達峰時間；AUC為藥時曲線下總面積；CL/F(s)為藥物的表觀清除率；V/F(c)為中央室表觀分布容積。

In the column of unit， unit listed before [ ] was used for indexes in plasma， while the unit listed in [ ] was used for indexes in liver and muscle.A， Intercept of distribution phase at 0 h;Ka， absorption rate constant;Ke， eliminate rate constant;T1/2(Ka)， absorption half-life;T1/2(Ke)， elimination half-life;T(Peak)， peak time; AUC， total area under drug time curve; CL/F(s)， apparent clearance; V/F(c)， apparent volume of distribution in central compartment .

2.5 多峰現(xiàn)象的研究與探討

藥動學(xué)研究通過組織中藥物濃度-時間的變化，借助相關(guān)的數(shù)學(xué)模型和藥動學(xué)處理軟件，計算出一系列藥動學(xué)參數(shù)，反映藥物在體內(nèi)的動態(tài)變化特征。在藥時曲線圖中，會出現(xiàn)雙峰曲線或多峰曲線的現(xiàn)象，即有多個達峰濃度和達峰時間。一般認(rèn)為，出現(xiàn)多峰現(xiàn)象的原因可能有：1)口服或灌胃給藥時，藥物在胃腸道中的多個位點被吸收，每個位點的吸收量與速率不同，在不同時間疊加形成血藥中的多峰現(xiàn)象；2)藥物的肝腸循環(huán)作用(hepato-enteral circulation)[10]，即膽汁排泄后的藥物經(jīng)膽汁排入十二指腸后，部分藥物可再經(jīng)小腸上皮細胞被重新吸收，在藥動學(xué)上表現(xiàn)為藥時曲線出現(xiàn)雙峰，在藥效學(xué)上表現(xiàn)為藥物的作用時間明顯延長，以及連續(xù)給藥方式導(dǎo)致藥時曲線圖中出現(xiàn)雙峰曲線或多峰曲線。連續(xù)多次給藥可以維持藥物在生物體內(nèi)的濃度，同時使得濃度上下波動，間隔時間越長，波動越大。房文紅等[8]開展了歐洲鰻鱺體內(nèi)恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星的藥動學(xué)研究，10 mg·kg-1劑量的恩諾沙星經(jīng)過單次給藥后進入歐洲鰻鱺體內(nèi)，藥時曲線中觀察到多峰現(xiàn)象；張德云等[11]研究了日本鰻鱺體內(nèi)恩諾沙星的藥動學(xué)規(guī)律，連續(xù)投喂7 d，每天口服給藥2次，每次劑量9 mg·kg-1，給藥期間日本鰻鱺體內(nèi)各組織中的恩諾沙星含量呈現(xiàn)多峰現(xiàn)象；Lewbart等[12]比較研究了單次口服給藥和藥浴方式下恩諾沙星在紅水虎魚血漿中的代謝動力學(xué)，結(jié)果表明，通過單次口服給藥的紅水虎魚血漿中的藥時曲線出現(xiàn)了四峰現(xiàn)象。本研究采用了30 mg·kg-1的劑量，連續(xù)5 d，每天投喂1次恩諾沙星，在大口黑鱸肌肉中同樣出現(xiàn)了雙峰曲線，表明恩諾沙星在大口黑鱸體內(nèi)可能存在肝腸循環(huán)作用。

2.6 藥效及休藥期研究

喹諾酮類藥物屬于濃度依賴型抗菌藥物，對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的細菌性疾病的治療效果與峰濃度(Cmax)/最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration， MIC)等參數(shù)有關(guān)。一般認(rèn)為：Cmax/MIC>8時，藥物即可起到良好的治療效果；當(dāng)Cmax/MIC=10時，可發(fā)揮最大治療效果[13-14]。恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的MIC為0.5 μg·mL-1[15]，對遲緩愛德華氏菌的MIC為0.5 μg·mL-1[16]，對溶藻弧菌、最小弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌4種12株菌的MIC為0.1～0.8 μg·mL-1[17]?？偨Y(jié)可知，恩諾沙星對大多數(shù)魚致病菌的MIC在0.1～1.0 μg·mL-1，本實驗表明，25 ℃下，當(dāng)用30 mg·kg-1的劑量連續(xù)5 d混飼給藥后，恩諾沙星在大口黑鱸血液、肝臟和肌肉中的Cmax分別為12.12、15.89、15.22 μg·g-1，Cmax/MIC的值均大于10，能夠滿足治療需要。在實際用藥時，應(yīng)根據(jù)感染的菌種及發(fā)病期等因素對癥下藥，調(diào)整劑量及使用周期，以減少耐藥性的產(chǎn)生。

休藥期也叫消除期，可以反映動物從停止給藥到許可屠宰或其乳、蛋等產(chǎn)品許可上市的間隔時間的長短。影響休藥期的因素很多，有種屬因素、環(huán)境因素等。原農(nóng)業(yè)部第278號公告規(guī)定，恩諾沙星在禽類中的休藥期為8 d，在牛、羊中均為14 d，在豬中為10 d，在兔中為14 d，但未規(guī)定其在水產(chǎn)品中的休藥期標(biāo)準(zhǔn)。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的品種眾多，使用的漁藥種類及各種藥物的制劑類型也較多，極有必要結(jié)合水產(chǎn)養(yǎng)殖的制劑水平和用藥方式開展休藥期研究。根據(jù)原農(nóng)業(yè)部公告《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》(農(nóng)牧發(fā)〔2002〕235號)，恩諾沙星牛、羊肌肉中的含量不得高于0.1 mg·kg-1，按此標(biāo)準(zhǔn)，本實驗在360 h后，即15 d后，大口黑鱸可食部分肌肉中的恩諾沙星含量小于0.1 mg·kg-1。因此，在25 ℃的條件下，恩諾沙星在大口黑鱸體內(nèi)的休藥期為15 d。

3 結(jié)論

應(yīng)用液相色譜技術(shù)測定了連續(xù)5 d口服30 mg·kg-1劑量的恩諾沙星后，不同時間點大口黑鱸體內(nèi)各組織中恩諾沙星的含量，建立藥時曲線，并通過3p97藥動學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計算得到藥動學(xué)參數(shù)，探討恩諾沙星在大口黑鱸體內(nèi)的代謝動力學(xué)規(guī)律。結(jié)果表明，30 mg·kg-1劑量(以體質(zhì)量計)的恩諾沙星在大口黑鱸養(yǎng)殖中能夠滿足治療的需要，25 ℃環(huán)境下建議的休藥期為15 d。