芥菜型油菜毛狀根誘導體系構建及TTG1基因功能初步研究

李 隆 程 成 伍小方 張大為 劉麗莉 周 靜周美亮 張凱旋,* 嚴明理,*

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芥菜型油菜毛狀根誘導體系構建及基因功能初步研究

李 隆1,2程 成1,2伍小方1,2張大為1,3劉麗莉1,3周 靜1周美亮2張凱旋2,*嚴明理1,3,*

1湖南科技大學生命科學學院, 湖南湘潭 411201;2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100081;3湖南科技大學重金屬污染土壤生態(tài)修復與安全利用湖南省普通高等學校重點實驗室, 湖南湘潭 411201

黃籽油菜具有種皮薄、出油率高等優(yōu)點, 研究油菜黃籽的形成具有重要的意義。前期研究表明,(TRANSPARENT TESTA GLABRA 1)基因參與了油菜種皮顏色的形成。本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株誘導了芥菜型油菜四川黃籽的毛狀根, 并研究了菌液濃度和外植體部位對誘導率的影響。結果表明, 菌液濃度OD值為0.8時, 誘導效率最高, 平均為71.5%; 外植體中下胚軸的發(fā)根率最高, 平均為87.3%。在四川黃籽毛狀根中過表達基因, 發(fā)現(xiàn)原花色素合成途徑中的(dihydroflavonol4-reductase)、(anthocyanidin synthase)和(anthocyanidin reductase)基因的表達受到抑制。本研究優(yōu)化了油菜毛狀根的誘導體系, 為利用毛狀根體系進行基因功能驗證提供了新的思路和方法。

芥菜型油菜; 毛狀根; 誘導條件;基因; 原花色素

毛狀根用于研究植物次生代謝活性物質在十幾年來一直受到了很大關注, 以植物毛狀根為反應器, 利用基因工程技術生產(chǎn)生物堿、蒽醌類、類黃酮、皂苷類、萜類等物質成為研究熱點[1]。毛狀根, 又稱發(fā)狀根、發(fā)根, 是發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物后產(chǎn)生的一種病理狀態(tài), 具有生長速度快、轉化效率高等特點。與毛狀根體系相比, 傳統(tǒng)的遺傳轉化體系要經(jīng)歷萌發(fā)培養(yǎng)、預培養(yǎng)、共培養(yǎng)、脫分化、生根培養(yǎng)等階段; 在芥菜型油菜遺傳轉化體系過程中需要添加2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)預培養(yǎng), 6-BA (6-benzylaminopurine)和AgNO3出芽分化, IAA (indole-3-acetic acid)和NAA (1-naphthylacetic acid)等生根培養(yǎng), 其操作比較繁瑣[2-3]。在毛狀根中過表達基因或用RNA干擾技術來研究植物次生代謝產(chǎn)物成為一種快速有效的研究方法[4-5]。有研究報道, 轉基因油菜毛狀根比野生型毛狀根富集Cd的能力強[6]。但是目前對油菜毛狀根的研究報道較少, 芥菜型油菜毛狀根培養(yǎng)還未有報道。

油菜種皮顏色的差異是由于黃酮生物合成途徑中原花色素(proanthocyanidins)在種皮內(nèi)皮細胞中是否沉積所引起的[7]。芥菜型油菜黃籽種皮中關鍵酶基因(dihydroflavonol4-reductase)、(antho-cyanidin synthase)和(anthocyanidin reductase)不表達造成白花色苷、花色素、表兒茶素無法合成, 原花色素所需要的上游產(chǎn)物被阻斷, 使色素無法積累, 導致種皮透明[8-10]。在擬南芥中, MYB類型轉錄因子TT2、bHLH類型轉錄因子TT8和WD40類型轉錄因子TTG1形成MBW復合物調(diào)控原花色素的生物合成, MBW復合體可以結合在等關鍵酶基因的啟動子上, 控制和酶基因的表達來調(diào)控原花色素的生物合成[11-13]。甘藍型油菜中基因可以調(diào)控種皮顏色和脂肪酸的含量[14]。芥菜型油菜基因的自然突變, 使MBW復合體不能結合和啟動子而導致原花色素代謝途徑不能正常表達, 原花色素無法積累, 種皮透明[15-16]。陳明訓等[17]把谷子的基因轉入擬南芥中,通過調(diào)控類黃酮途徑相關酶基因的表達來影響色素積累, 改變了擬南芥的種皮顏色和厚度。在擬南芥突變體中, 類黃酮含量影響了生長素的運輸和植物表型, 突變體根的長短、生長方向、花序多少、果角長度、側根密度等性狀都發(fā)生了改變[18]。在黃瓜中,參與調(diào)控植物的葉毛形成, 對外來生物侵害起到一定的防御作用, 也影響了黃瓜的表型[19]。目前基因參與油菜原花色素代謝途徑的功能還未驗證, 因此通過在毛狀根中過表達基因, 可以分析基因在油菜原花色素代謝途徑中的功能。

本研究對芥菜型油菜毛狀根誘導體系做了探索,構建過表達載體并轉入毛狀根中進行功能的初步研究, 為利用和開發(fā)油菜種皮顏色基因奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以芥菜型油菜四川黃籽(自交系, 種皮為黃色)為材料, 獲得油菜組培苗。培養(yǎng)基類型為MS固體培養(yǎng)基; 光照時間為16 h d–1; 光照強度6000 μmol m–2s–1; 培養(yǎng)溫度為(25±2)℃; 發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所蕎麥基因資源創(chuàng)新研究組提供; 載體為pCAMBIA3301。

1.2 目的基因的克隆

利用TRIzol法提取油菜葉片總RNA, 按全式金生物試劑公司的說明書進行反轉錄操作, 以cDNA作為PCR模板。反轉錄反應體系為20 μL, 含2 μL RNase-free Water、10 μL 2×TS Reaction Mix、4 μL總RNA、1 μL gDNA Remover、1 μL Anchored Oligo(dT) Primer (0.5 g μL–1)、1 μL Random Primer (0.1 g μL–1)和1 μL Mixrans Script RT/RI Enzyme Mix。反轉錄程序為25℃ 5 min, 42℃ 1 h, 75℃滅活5 min, 室溫冷卻5 min, 反應完成后離心, 作為PCR反應的模板。參考已報道的芥菜型油菜基因CDS序列[20], 利用Primer5.0 軟件引物設計, 上游引物序列為5′-ATGGATAACTCAGCTCCGGA-3′, 下游引物序列為5′-CTCAAACTCTAAGGAGCTGC A-3′。PCR反應總體系20 μL, 含1 μL反轉錄產(chǎn)物、上下游引物各1 μL (10 mmol L–1)、10 μL REMiX和ddH2O (補足到20 μL), 以上試劑購自北京天根生物公司。PCR反應程序為95℃預變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 31個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。PCR結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4.0進行切膠回收純化后, 連接到pMD19-T Vector (TaKaRa)上, 熱激轉化到大腸桿菌DH5α, 進行氨芐(Ampicillin)抗性篩選。挑取單克隆菌株進行液體培養(yǎng), 用M13引物進行菌液PCR檢測。選取含陽性質粒的菌液送北京奧科鼎盛生物科技有限公司用M13引物進行雙向測序, 將測序結果進行拼接, 得到序列與文獻上進行比對。應用DNAMAN軟件將氨基酸序列進行多序列比對, 結果顯示氨基酸序列一致。

1.3 載體的構建和轉化

根據(jù)同源重組的方法在上下游引物前加入15 bp載體同源序列和酶切位點, 上游引物TTG1-F (5′- ACGGGGGACTCTTGACCATGGATGGATAACTCAGCTCCGGA-3′) 和下游引物TTG1-R (5′-GGGAAA TTCGAGCTGGTCACCCTCAAACTCTAAGGAGCTGCA-3′), 酶切位點為I和91 I。以T載體作為模板進行PCR擴增, PCR方法和體系與1.2相同, 切膠回收純化與1.2相同。對pCAMBIA3301進行I和91 I雙酶切。酶切體系為10 μL, 含質粒DNA 6 μL、I和91 I各1 μL、10×buffer Fly 1 μL、ddH2O補至10 μL, 37℃放置2 h。片段與純化pCAMBIA3301連接。采用同源重組方式進行載體連接, 體系10 μL, 含PCR純化產(chǎn)物1 μL、5× Ligation-Free Cloning Master Mix 4 μL、pCAMBIA 3301 2 μL、用ddH2O補至10 μL。反應條件為冰浴30 min。熱激轉化到大腸桿菌的方法和測序與1.2相同。農(nóng)桿菌制備以及轉化, pCAMBIA3301空載體轉入農(nóng)桿菌A4方法參照文獻中報道的方法[21]。通過PCR鑒定轉基因和基因的發(fā)根農(nóng)桿菌A4。反應程序為95℃預變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 31個循環(huán), 最后72℃延伸10 min。PCR結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 油菜毛狀根的誘導

用培養(yǎng)7 d的油菜幼苗的子葉和下胚軸作為外植體與發(fā)根農(nóng)桿菌A4共培養(yǎng)。當農(nóng)桿菌OD值為0.8時, 離心(5000 r min–1) 15 min, 去上清, 用等體積的MS液體培養(yǎng)基將其重懸。將外植體放入A4侵染液中接種5 min, 在無菌濾紙上吸干, 25℃在黑暗條件下MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d后, 將外植體用含有頭孢噻肟(100 mg L–1)的MS液體培養(yǎng)基漂洗5次, 并在無菌濾紙上吸干, 然后25℃光照條件下在含有100 mg L–1頭孢噻肟MS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。接種2~3周后, 切除單一生長根并接種在含有100 mg L–1頭孢噻肟的MS培養(yǎng)固體基上。將毛狀根在25℃黑暗中培養(yǎng), 每5周繼代一次, 將約100 mg根(3 cm長度)接種到含有40 mL液體MS培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中, 并在25℃的搖床(100 r min–1)上黑暗培養(yǎng)。轉和基因的誘導方法與1.2相同, 最后在含Basta抗性的MS培養(yǎng)基上進行抗性篩選, 以獲得轉基因的無菌毛狀根。

1.5 油菜毛狀根誘導條件的優(yōu)化

為尋找發(fā)根農(nóng)桿菌促進芥菜型油菜毛狀根發(fā)根的最佳菌液濃度, 分別用OD值為0.4、0.6、0.8、1.0的菌液侵染油菜外植體, 侵染方法與1.2相同。用子葉和下胚軸的發(fā)根率來評價外植體對毛狀根發(fā)根率的影響。使用Microsoft Excel軟件統(tǒng)計分析。

1.6 轉基因毛狀根的鑒定

采用CTAB法提取毛狀根總DNA,引物設計為5'-AACGGGGAAACTCAGCAAGC-3'和5'-CA AATCGCCGCTTTGGACATA-3', 目的基因285 bp。引物設計為5'-TGACGCACAATCCCACTAT CCTT-3'和5'-CAGAACTCGCTCGTCTTGCTGTT-3'。目的基因488 bp, 通過PCR對轉入基因和基因的毛狀根進行鑒定, 反應程序為95℃預變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 31個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。PCR反應結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 GUS染色鑒定轉化效率

(1)用預冷的90%丙酮固定10 min, 4℃保存, 待用。用未添加X-Gluc的染色緩沖液潤洗; (2)用預冷的染色緩沖液浸泡, 抽真空10 min, 37℃溫育; (3)先后用50%、70%和100%的乙醇漂洗樣品, 每次浸泡5 min; (4)加入100%乙醇浸泡直至完全脫色; (5)體視顯微鏡照相記錄。

1.8 原花色素合成途徑中基因的表達量分析

利用qRT-PCR對轉基因的四川黃籽毛狀根中的基因進行表達分析。RNA提取和cDNA合成方法同1.2。按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Low ROX Premixed) (Vazume, Q3301-02)說明書分析表達量, 每個樣品3次重復。PCR體系為ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL、0.5 μmol上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL (50 ng μL–1)、RNase Free ddH2O補足至20 μL。在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行反應, 反應程序為95°C預變性60 s; 95°C變性20 s, 55°C退火20 s, 72°C延伸45 s, 40個循環(huán)。反應結束后分析熒光值變化曲線和溶解曲線, 采用2–ΔΔCt的方法分析實驗結果[22]。qRT-PCR引物相關信息見表1。

2 結果與分析

2.1 毛狀根誘導過程

使用不同濃度(OD值分別為0.4、0.6、0.8、1.0) 的野生型農(nóng)桿菌A4侵染四川黃籽子葉和下胚軸,當菌液OD值為0.8時, 發(fā)根率最高, 平均誘導效率為71.5% (圖2)。當菌液濃度為0.8時, 使用不同外植體進行侵染時, 其下胚軸發(fā)根率明顯高于子葉(表2)。未侵染成功的外植體1周以后開始產(chǎn)生褐色, 最終死亡。從誘導毛狀根發(fā)根到轉化培養(yǎng), 再到生長充滿整個培養(yǎng)瓶需要40~60 d。毛狀根誘導過程如下, 將四川黃籽種子消毒處理后接種在MS固體培養(yǎng)基, 培養(yǎng)14 d (圖1-A); 剪取油菜的無菌苗外植體, 使用A4侵染液侵染, 生長7 d的外植體誘導出的毛狀根(圖1-B); 繼續(xù)培養(yǎng)14 d, 外植體上的毛狀根長滿整個培養(yǎng)基(圖1-C); 剪取生長快速的毛狀根移入新的培養(yǎng)基, 培養(yǎng)14 d后獲得生長旺盛的毛狀根(圖1-D); 將獲得的無菌毛狀根接種至MS液體培養(yǎng)基中, 7 d后開始快速生長, 側枝分支增加(圖-E); 培養(yǎng)21 d后, 液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量毛狀根(圖1-F)。

表1 qRT-PCR引物表

2.2 過表達載體的構建和轉化的檢測

載體構建時選用的是pCAMBIA3301載體, 把原始的基因切掉以后連接上基因。載體構建如圖3所示, 把pCAMBIA3301載體轉入發(fā)根農(nóng)桿菌A4感受態(tài)中, 利用PCR對pCAMBIA3301-1的菌液進行陽性檢測, 同時鑒定含有陽性質粒的毒性區(qū)、以及轉移區(qū)的左右邊界和, 引物序列參考王成龍[23]苦蕎毛狀根的誘導及高頻再生體系的建立。由圖4可知, 在轉化過的農(nóng)桿菌A4中檢測出基因和基因, 說明pCAMBIA3301-和pCAMBIA3301質粒已經(jīng)成功轉入A4感受態(tài)中。

圖1 毛狀根的誘導過程

A: 14 d的四川黃籽油菜幼苗; B: 誘導7 d發(fā)根的外植體; C: 14 d以后的毛狀根; D: 21 d以后轉移到篩選培養(yǎng)基; E: 28 d在液體培養(yǎng)基上; F: 42 d以后的毛狀根。

A: 14 d SY rape sterile seedling; B: 7 d explants with hairy roots; C: 14 d hairy roots; D: 21 d hairy roots on the screening medium; E: 28 d hairy roots in the liquid medium; F: 21 d hairy roots in the liquid medium.

表2 不同外植體對油菜毛狀根誘導率的影響

Table 2 Effects of different explants on the induction rate of hairy roots

菌液濃度的OD值為0.8。不同小寫字母標識表示差異顯著(< 0.05)。

The OD value of the broth concentration was 0.8. Different lowercase letters indicated a significant difference (< 0.05).

圖2 不同濃度菌液對毛狀根的誘導效率

圖3 載體構建圖

A: pCAMBIA3301載體; B: 改造后的載體。

A: pCAMBIA3301 vector; B: pCAMBIA3301 vector containinggene.

2.3 轉基因毛狀根的檢測

從轉化的材料中選擇了3個轉基因的毛狀根分別命名為Z1、Z2、Z3, 3個轉基因的毛狀根命名為T1、T2、T3, 檢測均呈陽性, 由圖5-A可知, 轉基因毛狀根PCR檢測條帶為285 bp, 說明基因已經(jīng)成功轉入毛狀根中。由圖5-B可知, 轉基因毛狀根的目的基因片段條帶為488 bp, 說明基因已經(jīng)成功轉入毛狀根中。隨后對PCR鑒定為陽性的的轉基因的Z1、Z2、Z3進行GUS染色(圖6)。

2.4 轉基因毛狀根的生長分析

為進一步對轉入和基因對毛狀根的形態(tài)和生長狀況進行分析。分別剪取約0.5 cm野生型四川黃籽油菜(圖7-A1)、轉基因(圖7-B1)和轉基因(圖7-C1)的毛狀根根尖, 置MS固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)2周左右, 分別獲得野生型四川黃籽油菜(圖7-A2)、轉基因(圖7-B2)、轉基因(圖7-C2)的毛狀根生長狀態(tài)。從圖中可以看出, B2 (轉基因)和C2 (轉基因)的毛狀根比野生型的A2生長速度快, 出現(xiàn)分枝數(shù)多且粗壯。

圖4 轉化菌液的檢測

A: 35S-陽性檢測結果。+: pCAMBIA3301-,-: H2O; B:陽性檢測結果。+: pCAMBIA3301質粒,-: H2O。

A: identification ofgene inA4. +: pCAMBIA3301-,-: H2O; B: identification ofgene inA4. +: pCAMBIA3301 plasmid,-: H2O.

圖5 轉基因毛狀根的鑒定

A: 轉基因的3個根系Z1、Z2、Z3的PCR陽性檢測。+: pCAMBIA3301質粒;-: 野生型毛狀根; B: 轉基因的3個根系T1、 T2、T3的PCR陽性檢測。+: pCAMBIA3301-;-: 野生型毛狀根。

A: three lines of hairy roots overexpressinggene tested by PCR. +: pCAMBIA3301 plasmid;-: wild type hairy roots; B: three lines of hairy roots overexpressinggene tested by PCR. +: pCAMBIA3301-;-: wild-type hairy roots.

圖6 野生型和轉GUS基因毛狀根的染色結果

L1、L2、L3: 野生型的3個根系; Z1、Z2、Z3: 含有基因的3個根系。

L1, L2, L3: three lines of wild-type hairy roots; Z1, Z2, Z3: three lines of hairy roots overexpressinggenes.

圖7 野生型和轉基因毛狀根生長狀況

A1: 野生型毛狀根根尖轉入0 d狀態(tài); B1: 轉基因毛狀根根尖0 d狀態(tài); C1: 轉毛狀根根尖0 d狀態(tài); A2: 野生型毛狀根轉入14 d狀態(tài); B2: 轉基因毛狀根14 d狀態(tài); C2: 轉毛狀根14 d狀態(tài)。

A1: wild-type hairy root tip; B1:-overexpression hairy root tip; C1:-overexpressionhairy root tip; A2: 14 d old wild-type hairy roots; B2: 14 d old-overexpression hairy roots; C2: 14 d old-overexpression hairy roots.

2.5 基因表達量的檢測

由圖8可知, 與野生型相比, 轉基因材料的基因表達量提高了1.5倍, 轉基因毛狀根中、和的表達受到了抑制, 表達量分別為野生型的0.4、0.6和0.3倍, pCAMBIA3301-載體轉入毛狀根中抑制了、和基因的表達。

A:基因; B:基因; C:基因; D:基因。

A:gene; B:gene; C:gene; D:gene.

3 討論

3.1 毛狀根的誘導條件的優(yōu)化

建立快速穩(wěn)定的芥菜型油菜毛狀根體系和基因轉化體系有助于外源基因的轉入, 對轉基因功能驗證和次生代謝產(chǎn)物合成的研究有著重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn), 發(fā)根農(nóng)桿菌A4侵染芥菜型油菜不同的部位, 毛狀根誘導率存在很大差別, 下胚軸毛狀根生長數(shù)明顯高于子葉, 推斷下胚軸是油菜毛狀根產(chǎn)生的合適部位。另外, A4農(nóng)桿菌OD值在0.8時誘導效率最高, 這個濃度對其他類型的農(nóng)桿菌誘導油菜發(fā)根是不是最佳濃度需要進一步研究。轉基因和基因比野生型毛狀根粗大, 生長速度快而且分支數(shù)要多, 而轉和基因之間卻沒有明顯差別, 推斷外植體被轉化后有利于毛狀根的形成。傳統(tǒng)的油菜遺傳轉化體系是通過誘導愈傷組織等費時的操作, 得到T1代轉基因苗要6個月以上[4], 本研究40 d就可以誘導出穩(wěn)定的根系, 且毛狀根體系不用加植物生長調(diào)節(jié)劑, 操作簡單, 這為建立油菜快速的轉基因體系提供了參考。本研究油菜毛狀根體系的建立也可用于快速分析植物次生代謝通路中相關基因的表達。

3.2 TTG1基因表達與DFR、ANS和BAN基因表達的關系

在擬南芥突變體材料中,和基因表達水平會下降, 過表達促進了這3個酶基因的上調(diào)[24]。而本研究在黃籽油菜毛狀根中, 過表達基因對和基因表達沒有起到促進作用, 探究其原因, 可能是由于在四川黃籽中形成MBW復合體時,發(fā)生突變, MBW不能和、和啟動子相結合, 不能加強這3個酶基因的表達[14-15], 即使在毛狀根中過表達了, 也無法促使MBW復合體和這3個酶基因啟動子相結合, 促進其下游基因的表達(圖9)。正如岳迎春[7]在四川黃籽植株中過表達種皮并未變?yōu)楹谏? 仍然透明, 而且種子變小敗育。而在水稻中直接轉入多個原花色素合成途徑中的基因, 可以促進水稻胚乳中原花色素的積累, 白色變?yōu)樽仙玔25]。因此推斷單獨提高在四川黃籽植株中的表達量, 不能促進、和基因的表達。

圖9 擬南芥原花青素代謝途徑中TT2、TT8和TTG1形成MBW復合體調(diào)控DFR、ANS和BAN的示意圖

PA代謝途徑的酶基因分別為查爾酮合酶()、查爾酮異構酶()、黃烷酮3-羥化酶基因()、類黃酮3’-羥化酶基因()、二氫黃酮醇4-還原酶()、花青素合成酶()、花色素還原酶()、谷胱甘肽S-轉移酶()和MATE次級轉運子()。

The enzyme genes of the PA metabolic pathway arechalconesynthase (), chalconeisomerase(), flavanone3-hydroxylase(), flavonoid3'-hydroxylase (), dihydroflavonol4-reductase (), anthocyaninsynthase(), anthocyanidinreductase(), MATE secondary transporter(), and glutathione S-transferase().

4 結論

在芥菜型油菜四川黃籽中建立了毛狀根發(fā)根和基因轉化體系, 并利用GUS染色進行轉化效率的鑒定。在該體系下過表達基因會導致、和基因下調(diào)表達。

[1] Zhou M L, Zhu X M, Shao J R, Tang Y X, Wu Y M. Production and metabolic engineering of bioactive substances in plant hairy root culture., 2011, 90: 1229–1239

[2] Largia M J V, Satish L, Johnsi R, Johnsi R, Shilpha J, Ramesh M. Analysis of propagation of(L.) from hairy roots, elicitation andA contents of Ri transformed plants., 2016, 32: 131

[3] 黃建安, 劉仲華. 毛狀根培養(yǎng)與植物次生代謝物的生產(chǎn). 微生物學雜志, 2003, 23(5): 35–39 Huang J A, Liu Z H. Cultivation of hairy roots and production of plant secondary metabolites., 2015, 23(5): 35–39 (in Chinese)

[4] 袁玉輝. 芥菜型油菜干擾載體的構建及遺傳轉化. 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文, 湖南長沙, 2013 Yuan Y H. The Construction ofInterference Vector and Genetic Transformation of(L.). MS Thesis of Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan, China, 2013 (in Chinese with English abstract)

[5] 謝伶俐, 李加納, 殷家明, 柴友榮, 許本波, 林吶. 根癌農(nóng)桿菌介導轉化甘藍型油菜子葉基因瞬表達. 中國油料作物學報, 2007, 29(1): 9–13 Xie L L, Li J N, Yin J M, Chai Y R, Xu B B, Lin N. Transient expression ofgene in cotyledons of rapeseed mediated by., 2007, 29(1): 9–13 (in Chinese with English abstract)

[6] 劉靜軼. 發(fā)根農(nóng)桿菌介導基因轉化鎘超富集植物油菜的研究. 北京交通大學碩士學位論文, 北京, 2014Liu J T. Research on-mediatedGene Transformation in Cd HyperaccumulatorL. MS Thesis of Beijing Jiaotong University, Beijing, China, 2014 (in Chinese with English abstract)

[7] 岳迎春. 芥菜型油菜種皮顏色轉錄因子基因遺傳轉化體系優(yōu)化及種皮色素分析. 湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文, 湖南長沙, 2010 Yue Y C. Pigment Analysis of the Seed Coat Color Transcription Factor GeneGenetic Transformation System Optimization inMS Thesis of Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan, China, 2010 (in Chinese with English abstract)

[8] 嚴明理, 劉顯軍, 劉忠松, 官春云, 袁謀志, 熊興華. 芥菜型油菜4-二氫黃酮醇還原酶基因的克隆和表達分析. 作物學報, 2008, 34: 1–7 Yan M L, Liu X J, Liu Z S, Guan C Y, Yuan M Z, Xiong X H. Cloning and expression analysis of the dihydroflavonol 4-reductase gene in, 2008, 34: 1–7 (in Chinese with English abstract)

[9] Yan M L, Liu X J, Guan C Y, Chen X B, Liu Z S. Cloning and expression analysis of an anthocyanidin synthase gene homolog from., 2011, 28: 313–322

[10] Liu L L, Huang T, Ding S P, Wang Y, Yan M L.genes fromand: cloning, evolution and involvement in seed coat color., 2016, 155: 421–430

[11] Gonzalez A, Zhao M, Leavitt J M, Lloyd A M. Regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway by the TTG1/bHLH/Myb transcriptional complex inseedlings., 2008, 53: 814–827

[12] Albert S, Delseny M, Devic M. BANYULS, a novel negative regulator of flavonoid biosynthesis in theseed coat., 1997, 11: 289–299

[13] Zhang F, Gonzalez A, Zhao M, Payne C T, Lloyd A. A network of redundant bHLH proteins functions in all TTG1-dependent pathways of., 2003, 130: 4859–4869

[14] Zhou L H, Li Y L, Hussain N, Li Z L, Wu D Z, Jiang L X. Allelic variation of BnaC..a and its association with seed coat color and fatty acids in rapeseed (L.)., 2016, 11: e0146661

[15] Padmaja L K, Agarwal P, Gupta V, Mukhopadhyay A, Sodhi Y S, Pental D, Pradhan A K. Natural mutations in two ohomoeologousgenes control yellow seed coat trait in allotetraploid(AABB)., 2014, 127: 339–347

[16] 劉顯軍. 芥菜型油菜黃籽基因克隆和黃籽形成機制分析. 湖南農(nóng)業(yè)大學博士學位論文, 湖南長沙, 2013 Liu X J. Positional Cloning of the Gene for Seed Color and Molecular Mechanism of Yellow Seed Formation in. PhD Dissertation of Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan, China, 2013 (in Chinese with English abstract)

[17] Liu K G, Qi S H, Li D, Jin C Y, Gao C H, Duan S W, Feng B L, Chen M X. TRANSPARENT TESTA GLABRA 1 ubiquitously regulates plant growth and development fromto foxtail millet ()., 2017, 254: 60–69

[18] Buer C S, Djordjevic M A. Architectural phenotypes in the transparent testa mutants of.2009, 60: 751–763

[19] Liu X W, Bartholomew E, Cai Y L, Ren H Z. Trichome-related mutants provide a new perspective on multicellular trichome initiation and development in cucumber (L)., 2016, 7: 1187

[20] 嚴明理. 芥菜型油菜黃籽形成的分子機理研究. 湖南農(nóng)業(yè)大學博士學位論文, 湖南長沙, 2007 Yan M L. Studies on the Molecular Mechanism of Yellow- seeded Formation inPhD Dissertation of Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan, China, 2007 (in Chinese with English abstract)

[21] 朱寬鵬. 芪合酶基因在何首烏毛狀根中過量表達與dsRNA干擾. 華南理工大學碩士學位論文, 廣東廣州, 2012 Zhu K P. Double-stranded RNA-mediated Gene Silencing and Over-expression ofinThunb Hairy Roots. MS Thesis of South China University of Techno-logy, Guangzhou, Guangdong, China, 2012 (in Chinese with English abstract)

[22] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-delta delta C(T)) method., 2001, 25: 402–408

[23] 王成龍. 苦蕎毛狀根的誘導及高頻再生體系的建立. 四川農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文, 四川雅安 2015 Wang C L. Induction Hairy Roots and Established High- Frequency Plant Regeneration System of Tartary Buckwheat (Gaertn.), Ya’an, Sichuan, China, 2015 (in Chinese with English abstract)

[24] Hichri I, Barrieu F, Bogs J, Kappel C, Delrot S, Lauvergeat V. Recent advances in the transcriptional regulation of the flavonoid biosynthetic pathway., 2011, 62: 2465

[25] Zhu Q L, Yu S Z, Zeng D C, Liu H M, Wang H C, Yang Z F, Xie X R, Shen R X, Tan J T, Li H Y, Zhao X C, Zhang Q Y, Chen Y L, Guo J X, Chen L T, Liu Y G. Development of “purple endosperm rice” by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system., 2017, 10: 918–929

Construction of Hairy Root Induction System and Functional Analysis ofGene in

LI Long1,2, CHENG Cheng1,2, WU Xiao-Fang1,2, ZHANG Da-Wei1,3, LIU Li-Li1,3, ZHOU Jing1, ZHOU Mei-Liang2, ZHANG Kai-Xuan2,*, and YAN Ming-Li1,3,*

1College of Life Science, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan 411201, Hunan, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Key Laboratory of Ecological Remediation and Safe Utilization of Heavy Metal-Polluted Soils, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan 411201, Hunan, China

Yellow seed rape has the advantages of thin seed coat and high oil yield. It is of great significance to study the formation of yellow seed in rapeseed. Previous studies showed that(TRANSPARENT TESTA GLABRA 1) gene was involved in the formation of seed coat color. In this study,A4 strain was used to induce hairy roots of Sichuan yellow, and investigate the effects of bacterial concentration and different sources of explants on hairy root induction. The highest average rooting rate was 71.5% when the OD value ofA4 reached to 0.8. The average rooting rate of hypocotyls was significantly higher than that of cotyledons and up to 87.3% after the infection. Overexpression ofgene in Sichuan yellow hairy roots inhibited the expression of(Dihydroflavonol4-reductase),(Anthocyanidin synthase), and(Anthocyanidin reductase) genes, encoding key enzymes of the proanthocyanidins biosynthesis. In this study, we optimized the induction system of hairy roots in, and analyzed the function ofin the regulation of proanthocyanidins synthesis pathway, which provide a new idea and method for the functional analysis of genes in the hairy root system.

; hairy root; inducing condition;gene; proanthocyanidins

2018-02-14;

2018-06-12;

2018-07-02.

10.3724/SP.J.1006.2018.01468

嚴明理, E-mail: ymljack@126.com; 張凱旋, E-mail: zhangkaixuan@caas.cn

E-mail: 297478443@qq.com

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0100202), 湖南省自然科學基金項目(2016JJ1010), 國家自然科學基金項目(31572457)和湖南省教育廳項目(17K035)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program (2016YFD0100202), the Natural Science Foundation of Hunan Province (2016JJ1010), the National Natural Science Foundation of China (31572457), and the Foundation of Hunan Education Department (17K035).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180629.1901.012.html