蛛網膜下隙注射miR-30b對脊髓Nav1.3表達及神經病理性疼痛的影響

茹靖濤，李 鳴，蘇松雪，蔡偉華，曹 靖，臧衛(wèi)東，邵金平

1)河南省人民醫(yī)院骨二科 鄭州 450003 2)鄭州大學基礎醫(yī)學院人體解剖學系 鄭州 450001

電壓門控鈉離子通道亞型1.3(voltage-gated sodium channels subtype 1.3，Nav1.3)由基因Scn3A編碼，在嚙齒類動物中主要表達于胚胎神經元，于孕17 d達到峰值，出生15 d后降低，30 d后僅微量表達。盡管在成年大鼠背根神經節(jié)(dorsal root ganglia DRG)中僅能檢測到少量Nav1.3的表達，但在神經病理性疼痛時，DRG中的Nav1.3會重新高表達，并與神經病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展密切相關[1-2]。然而Nav1.3參與神經病理性疼痛的調控機制尚不明確。microRNAs (miRNAs)是一類具有19～25個核苷酸的非編碼RNA，其主要作用于轉錄后基因表達的調節(jié)。miR-30b是一個miRNA分子，參與癌癥和神經退行性疾病等；通過生物信息學軟件TargetScan預測miR-30b與編碼Scn3A的3’UTR區(qū)堿基互補配對。本研究通過制作大鼠脊神經結扎(spinal nerve ligation，SNL)神經病理性疼痛模型，利用熒光定量PCR、免疫熒光染色和Western blot方法，探討miR-30b調控Nav1.3 參與神經病理性疼痛的中樞機制。

1 材料與方法

1.1miR-30b與Scn3A靶標關系的驗證

1.1.1 主要材料和試劑 本研究使用的miR-30b的類似物(agomir)、抑制劑(antagomir)、擾亂序列(scramble)以及重組野生型(WT)和突變型(Mut)pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體均由上海吉瑪制藥有限公司提供(野生型載體為攜帶與miR-30b配對的Scn3A 3’UTR區(qū)的質粒，而突變型為攜帶Scn3A 3’UTR區(qū)亂序的質粒)。

1.1.2 細胞的轉染及分組 將大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞以5×104mL-1接種于24孔板中, 置于37 ℃、體積分數5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 細胞密度達50%時用于轉染。轉染前3 h將細胞培養(yǎng)基換成不含血清的新鮮培養(yǎng)基。實驗共分8組(每組均設3個復孔)：WT+scramble組(用脂質體轉染法共轉染野生型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b的scramble序列50 pmol/L)、 WT+agomir組(共轉染野生型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b agomir 50 pmol/L)、WT+antagomir組(共轉染野生型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b antagomir 50 pmol/L)、WT+NC組(共轉染野生型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b antagomir陰性對照50 pmol/L)、Mut+scramble組(共轉染突變型SCN3A 3’UTR載體和miR-30b的scramble序列50 pmol/L)、Mut+agomir組(共轉染突變型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b agomir 50 pmol/L)、Mut+antagomir組(共轉染突變型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b antagomir 50 pmol/L)和Mut+NC組(共轉染突變型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b antagomir陰性對照50 pmol/L)。共轉染后，培養(yǎng)6 h，換為含體積分數10%血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。

1.1.3 各組細胞中熒光素酶活性的檢測 吸出待檢細胞的培養(yǎng)基，PBS洗3次后，每孔加入100 μL裂解液，置于搖床振蕩20 min，充分裂解細胞。12 000 r/min離心5 min。取上清20 μL，加入96孔白板，每樣3個復孔，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)在Berthold Centro LB960 luminometer (Berthold Technologies)上檢測螢火蟲熒光強度與海腎素熒光強度的比值。

1.2大鼠SNL模型的制備及分組選用體重260～320 g的清潔級成年雄性SD大鼠(由河南省實驗動物中心提供)。體積分數2%異氟烷麻醉后，剃除背部骶部區(qū)域的毛，取俯臥位，體積分數10%聚維酮碘消毒、鋪巾，左側后背部L2～S1處依次縱行切開皮膚、筋膜、肌肉，約3 cm長切口(距背中線1.0 cm)。鈍性分離左側棘突至骶骨的椎旁肌肉，充分暴露L4-6椎體側緣和L5脊神經，結扎L5脊神經。假手術組則只暴露L5脊神經，其余過程同手術組。術后觀察大鼠恢復情況，如出現神經功能障礙(如癱瘓)或狀態(tài)不佳者，則剔除實驗。實驗共分4組(每組6只大鼠)：假手術組、SNL組(只進行SNL手術的大鼠)、SNL+scramble組[SNL大鼠鞘內置管注射miR-30b的擾亂序列(20 μmol/L，10 μL)，術后第10 天開始注射，連續(xù)注射4 d，1次/d]和SNL+agomir組[SNL大鼠鞘內置管注射miR-30b agomir(20 μmol/L，10 μL)，術后第10天開始注射，連續(xù)注射4 d，1次/d]。分別在術前1 d，術后第3、7和14天連續(xù)檢測行為學變化。

1.3 4組大鼠雙側后肢機械痛敏和熱痛敏的測定

1.3.1 4組大鼠50%縮足閾值(paw withdrawal threshold，PWT)的測定 采用經典von-Frey纖維，按Chaplan等[3]報道的方法測定。將大鼠置于金屬網上，蓋以透明的有機玻璃罩，先讓大鼠適應環(huán)境20 min, 待大鼠的梳理和探究活動基本消失后，用一系列標準化的von-Frey纖維(0.407, 0.692, 1.202, 2.041, 3.630, 5.495, 8.511, 15.140 g)刺激大鼠后肢足底，直至纖維彎曲成“S”形，持續(xù)5 s，觀察是否出現縮足反應。大鼠在刺激時間內出現快速的縮足反應，記為陽性反應，而身體活動所引起的縮足反應不記作陽性反應。應用Dixon[4]報道的方法推算出50% PWT。當50% PWT小于4 g時認為出現機械痛敏。

1.3.2 4組大鼠熱縮足潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)的測定 按照Hargreaves 等[5]報道的PWL測定方法，調整輻射熱的強度，使大鼠PWL基礎值保持在9～12 s，然后設定輻射光熱測痛儀參數，設定熱輻射照射時間極限為20 s。將大鼠置于有機玻璃板上, 蓋以透明的有機玻璃罩, 讓大鼠在透明框中自由活動20 min以適應環(huán)境，玻璃板的溫度保持在(26.0±0.5) ℃，調節(jié)玻璃板下的輻射光源，使其對準大鼠后足掌心部，照射足底，大鼠出現縮足反應或照射時間達20 s，光源自動關閉，并自動記錄時間。正常的大鼠PWL通常為9～14 s。每側在同一部位測量3次，兩次測量間隔10 min，取平均值。

1.4 4組大鼠脊髓背角組織中Scn3AmRNA和Nav1.3蛋白表達的檢測術后14 d處死各組大鼠，取大鼠術側L4-5脊髓背角組織，分別利用熒光定量PCR和Western blot的方法檢測Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白的表達。

1.4.1 Scn3A mRNA表達的熒光定量PCR檢測 Trizol法提取總RNA，利用M-MLV反轉錄酶獲得cDNA。使用熒光定量PCR檢測試劑盒[購自天根生化科技(北京)有限公司] 檢測。PCR反應條件：預變性50 ℃ 2 min;變性95 ℃ 10 min，退火95 ℃ 15 s，延伸60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。GAPDH為內參。采用2-ΔΔCt計算各目的基因的相對表達量。實驗所用基因名稱和引物序列見表1。

表1 基因名稱和引物序列

1.4.2 Nav1.3蛋白表達的Western blot檢測 將組織置于勻漿器中，加入 0.5 mL 細胞裂解液，手動勻漿至組織完全裂解，收集裂解液，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。BCA 法測蛋白質濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min使蛋白質變性。SDS-PAGE電泳分離蛋白質，轉膜，封閉，一抗[兔抗大鼠Nav1.3抗體(按1∶300稀釋，Abcam公司)和β-actin(按1∶1 000稀釋)]孵育，4 ℃過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗(按1∶1 000稀釋， Jackson公司)，室溫孵育2 h，TBST洗膜后加入顯色液，凝膠成像及分析系統(tǒng)中成像。以目的條帶與β-actin的比值，再以假手術組進行標準化來表示蛋白水平。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0進行分析。應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組細胞中熒光強度、各組大鼠術側脊髓背角組織中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白表達的差異，應用重復測量數據的方差分析比較各組大鼠術前和術后不同時間后肢機械痛敏和熱痛敏的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1miR-30b與Scn3A靶標關系的驗證結果見表2。由表2可知，共轉染WT Scn3A 3’UTR載體和miR-30b agomir(WT+agomir組)后熒光強度較轉染WT+scramble組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。而共轉染WT Scn3A 3’UTR載體和miR-30b antagomir對熒光強度無影響。此外，miR-30b agomir對突變體載體熒光強度的表達無影響。

表2 各組細胞中熒光強度的比較 %

*：F=91.840，P<0.001?！鳎号cWT+scramble組相比，P<0.05；#：與Mut+agomir組相比，P<0.05

2.2各組大鼠雙側后肢機械痛敏和熱痛敏的比較見表3。由表3可知，與假手術組相比，SNL組和SNL+scramble組的大鼠術后3、7和14 d術側后肢50% PWT均降低，對側后肢無明顯變化。與SNL+scramble組相比，SNL+agomir組PWT升高，差異有統(tǒng)計學意義，而對側后肢無明顯變化。SNL組和SNL+scramble組大鼠術后3、7和14 d術側后肢PWL較假手術組降低，而對側后肢無變化。注射miR-30b agomir后，SNL大鼠術側PWL延長，與注射scramble組相比，差異有統(tǒng)計學意義，而對側熱痛敏無明顯變化。

表3 各組大鼠后肢機械痛敏和熱痛敏的比較

*：與假手術組相比，P<0.05；#：與SNL+scramble組相比，P<0.05

2.3各組大鼠脊髓背角組織中Scn3AmRNA和Nav1.3蛋白表達的比較見表4。由表4可知，SNL組和SNL+scramble組大鼠術側脊髓背角組織中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白表達較假手術組增加。相反，在術后10 d，對SNL大鼠鞘內連續(xù)注射miR-30b agomir 4 d后，SNL+agomir組大鼠術側脊髓背角組織中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白表達降低，與SNL+scramble組相比，差異有統(tǒng)計學意義；提示SNL誘導的神經病理性疼痛可使脊髓背角組織中Nav1.3蛋白表達增加，而過表達miR-30b可降低SNL大鼠脊髓背角組織中Nav1.3蛋白的表達。

表4 各組大鼠術側脊髓背角組織中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白的表達

*與假手術組相比,P<0.05;#:與SNL+scramble組相比,P<0.05

3 討論

神經性病理疼痛的發(fā)病機制包括外周神經的興奮性增高、中樞敏化、大腦下行易化等幾個方面。脊髓的中樞敏化是其中的重要機制之一，研究其機制對治療神經病理性疼痛至關重要。

脊髓的神經元表達多種離子通道蛋白，而離子通道功能的變化與神經元的興奮密切相關，因此，研究在神經性病理性疼痛的狀態(tài)下離子通道蛋白的變化對于疼痛機制的研究至關重要[6]。電壓門控鈉離子通道主要由 α亞基和 β亞基構成，其中 α亞基為功能亞單位,是介導鈉離子出入的孔道，與神經細胞的興奮性密切相關?，F已發(fā)現的功能性電壓門控鈉離子通道包括9種亞型，分別為Nav1.1～Nav1.9；其中Nav1.3在胚胎的神經系統(tǒng)廣泛表達，但在成年大鼠的神經系統(tǒng)幾乎不表達[7]。盡管在成年大鼠DRG中僅能檢測到少量Nav1.3的表達，但外周神經損傷后，其表達在DRG和患側脊髓背角中均增加[1-2]。Hains等[8]研究顯示在慢性壓迫損傷大鼠神經病理性疼痛模型中，脊髓背角Nav1.3 mRNA和蛋白水平表達均上調，鞘內注射Nav1.3反義寡核苷酸可抑制Nav1.3的表達，同時緩解疼痛，這與作者的結果相一致。雖然已有研究[9]證實Nav1.3在神經病理性疼痛模型的脊髓重新高表達與疼痛的發(fā)生密切相關，但其升高機制并不清楚。本研究試圖通過探索神經病理性疼痛發(fā)展階段(7 d以后)脊髓Nav1.3高表達的相關機制，尋找抑制其高表達的方法，從而探尋對神經病理性疼痛治療的新方法。

蛋白表達變化的調控機制有多種，包括轉錄前調控(如轉錄因子的變化、啟動子區(qū)的甲基化調控等[10])和轉錄后調控(如內源性miRNA的調控、mRNA的甲基化等[11])。miRNAs是一類具有19～25 個核苷酸的非編碼RNA，其主要作用為轉錄后調控。miRNA 和靶基因序列的互補程度決定了靶基因mRNA 在翻譯水平被部分抑制或者斷裂降解。當miRNA 與靶mRNA 完全結合時，靶mRNA 直接被降解；當不完全結合時，阻遏其翻譯蛋白。這是哺乳動物基因表達在翻譯水平抑制的主要方式。

基于Nav1.3在疼痛中的重要作用及在脊髓高表達的實驗結果，本實驗試圖尋求能夠調控Nav1.3的miRNA，探索抑制Nav1.3升高的新方法，為神經病理性疼痛的治療提供新的鎮(zhèn)痛靶點和方向。首先作者利用生物信息學軟件TargetScan發(fā)現miR-30b與Scn3A的3’UTR區(qū)序列互補配對，通過構建重組與miR-30b互補的Scn3A的3’UTR雙熒光素酶基因報告載體，在細胞水平驗證了miR-30b可直接作用于Scn3A的3’UTR并負調控Scn3A的表達。為了檢測在體給予miR-30b的鎮(zhèn)痛效果，作者利用大鼠SNL神經病理痛模型，通過蛛網膜下隙給予miR-30b的類似物agmir過表達miR-30b，發(fā)現可以逆轉脊髓中Nav1.3蛋白高表達，同時SNL模型的神經病理性疼痛行為也被反轉。

上述實驗驗證了依靠在體轉染試劑的幫助，miRNA的確可以轉染到在體組織中，并發(fā)揮生物活性。而miRNA-30b抑制神經性病理疼痛的機制可能是通過直接作用于編碼Nav1.3 mRNA的3’UTR區(qū)發(fā)揮轉錄后調控作用，從而抑制Nav1.3的表達所致。因此脊髓水平的Nav1.3有可能作為疼痛治療的靶點，而蛛網膜下隙注射miRNA可望成為治療疼痛的又一個新的手段。