miR-126促進脊髓損傷模型神經干細胞的生長增殖和分化

張永濤 高淵濤 李 宵 付明陽 田 峰 李鵬飛 劉 芳 王春芳△

(1 山西醫(yī)科大學實驗動物中心, 實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室, 太原 030001; 2 南昌大學瑪麗女王學院, 南昌 330031)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是常見的一種創(chuàng)傷性疾病,有多種原因引起[1],近20年來發(fā)病率明顯增高[2]。由其引起的嚴重殘疾和醫(yī)療費用已成為患者及其家庭和社會的沉重負擔[3-4]。目前,治療脊髓損傷的措施主要有手術、藥物以及細胞移植治療等,神經干細胞治療是最有前景的治療方案[5],其可在損傷部位存活增殖并分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞,且誘導宿主5-羥色胺能纖維的軸突再生,從而促進運動功能修復[6-8]。但神經干細胞的來源、免疫排斥以及倫理問題等一直制約著其臨床應用[9-10]。如何誘導內源性神經干細胞活化、增殖及定向分化,已成為今后研究的趨勢。神經干細胞能否很好地促進脊髓損傷功能修復,主要取決于神經干細胞在損傷部位的生長、增殖以及向神經元的分化。microRNA是一種小分子非編碼RNA,近期研究報道其廣泛表達于中樞神經系統(tǒng)[11],與靶基因的mRNA特異性相結合,在轉錄后水平調控著神經干細胞的生長、增殖、分化和凋亡等多種生物學功能。其中miR-126對神經干細胞的生長增殖、分化的調節(jié)作用尤其重要[12-13],但其具體作用機制尚不清楚。有報道m(xù)iR-126可以通過綁定到同源框來調控HOXA9,而HOXA9又是脊髓運動神經元的發(fā)育過程中的關鍵基因[15]。因此,本研究探討miR-126通過調節(jié)HOXA9的表達發(fā)揮對神經干細胞的調控作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級成年FVB小鼠42只,體質量25～30g,由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供,恒溫恒濕,晝夜各半,自由飲食。

1.2 主要試劑

H-E染色試劑盒(Solarbio,中國);尼氏染色試劑盒(Beyotime，中國);microRNA Isolation Kit (Life Technologies,美國); Prime-Script RT試劑盒(TaKaRa,Tokyo,日本);SYBR?Select Master Mix(Applied Biosystems,美國);增強型RIPA裂解液(Boster,中國);nestin、HOXA9兔抗鼠多克隆抗體、GAPDH兔抗鼠多克隆抗體、羊抗兔抗體(HRP)(Abcam,美國)。

1.3 模型制作

將小鼠隨機分為實驗組(36只)和對照組(6只)。實驗組吸入麻醉成功后固定于手術臺,應用Impactor M-Ⅲ spinal cord contusion system(W. M Keck Center for Collaborative Neuroscience Rutgers, the State Univesity of New Jersey, USA),采用Allen法制作第10胸椎(T10)脊髓損傷模型(質量5g,垂直高度25mm)。術后常規(guī)逐層縫合。術后3d,肌注青霉素G(4000u),預防感染。每天輔助排尿,直至完全恢復自主排尿。

1.4 運動功能評分

1.5 H-E染色,尼氏染色

BMS評分后,0.9%生理鹽水心灌注,然后4%多聚甲醛灌注小鼠。隨后,解剖出脊髓損傷部位,置于4%多聚甲醛內固定24h,常規(guī)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟固定包埋備用;Leica切片機(RM2245 USA)每張5μm連續(xù)切片,60℃烘箱2h烘干備用。常規(guī)脫蠟至水,按H-E染色、尼氏染色試劑盒說明書進行染色后,梯度乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹脂封片后鏡下觀察并拍片記錄。

1.6 RT-PCR

提取同一節(jié)段的脊髓,應用microRNA Isolation Kit提取microRNA和總RNA。Taqman microRNA Assays試劑盒進行miR-126實時定量PCR(RT-PCR)檢測。miR-U6作為內參。為了測定mRNA的表達,使用Prime-Script RT試劑盒在PCR儀(Eppendorf, USA)上42℃ 60min,70℃ 15min進行逆轉錄(RT)反應,合成第一鏈。然后使用SYBR?Select Master Mix,在7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA)進行95℃ 10min預變性。95℃ 15s和60℃ 1min,40個循環(huán)。最后采用delta-delta CT方法定量基因表達變化,以GAPDH作內參,引物由華大基因(Beijing Genomics Institute, 中國)設計和合成。

1.7 免疫印跡檢測

取脊髓組織樣本加入增強型RIPA裂解液和1%PMSF,冰上研碎,4℃孵育4h后,12.0×103r/min,4℃ 下離心20min,取上清,經BCA蛋白濃度測定后-80℃保存?zhèn)溆?。應用等質量樣本30μg進行凝膠電泳,依照marker條帶切下目的條帶,轉膜15min,5%脫脂牛奶(伊利,中國)室溫下封閉非特異性條帶2h,一抗(1∶1000)4℃孵育過夜,TBS-T清洗后,二抗(1∶2000)室溫下避光孵育2h,TBS-T清洗后拍片保存,然后使用Quantity One 4.6.2 software (Bio-Rad, USA)進行量化分析。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 脊髓損傷不同時期運動功能評分

為了檢測小鼠脊髓損傷后運動功能的修復,應用BMS評分評估了小鼠后肢運動功能,術前實驗組與對照組BMS評分均為9分,實驗組術后在1、3、7、14、21、28d BMS評分(表1)顯示,1、3d時運動功能完全喪失,7d時運動功能出現(xiàn)恢復跡象,與第1、3天相比,14、21d恢復較為顯著,第28天時趨于平穩(wěn),與21d時相比差異無統(tǒng)計學意義。

表1 對照組與實驗組不同時期的BMS評分

**P<0.01vs1d

2.2 脊髓損傷后不同時期損傷情況及尼氏體的數(shù)量變化

為了檢測脊髓損傷后不同時期脊髓損傷部位病理學的變化,分別在不同時期取相同部位組織,石蠟包埋切片后進行H-E染色、尼氏染色。與對照組(圖1A1、A2)相比,損傷后第1天時(圖1B1、B2)可見局部正常組織結構形態(tài)完全喪失,細胞排列次序紊亂,出現(xiàn)大量的核碎裂,核濃縮,尼氏體大量減少,其間大量血細胞及炎性細胞積聚。3d時(圖1C1、C2)進一步加劇,尼氏體基本消失,第7天(圖1D1、D2)血細胞及滲出的炎性細胞被吸收,疏松紊亂的組織間隙被大量的組織間質充填。在不規(guī)則的組織中可見少量尼氏體出現(xiàn)。第14天(圖1E1、E2)水腫消退,并可見纖維疤痕及空洞形成。21d后(圖1F1、G1、F2、G2)纖維組織進一步增多,其間可見散在的尼氏體。

2.3 脊髓損傷后不同時期nestin的表達

為觀察神經干細胞在脊髓損傷后不同時期的變化,在不同時期對脊髓損傷部位神經干細胞的標記物nestin mRNA及其相應蛋白進行檢測。結果顯示，在脊髓損傷后早期Nestin mRNA的表達量(圖2A)明顯下降,而后逐漸升高,在21d(圖2A)時達到高峰后再次下降。Nestin蛋白(圖2B)的表達量具有相同趨勢。

圖2 Nestin mRNA (A)及其相應蛋白(B)表達的變化

2.4 脊髓損傷后miR-126的表達

為觀察脊髓損傷后不同時期miR-126的表達變化情況,在不同時期脊髓損傷部位進行RT-PCR檢測,所得數(shù)據(jù)顯示,脊髓損傷后miR-126總體表達量下降。早期(1～7d)下降最為明顯,而后逐漸升高,在21d時達到高峰,表達量高于對照組,而后再次下降(圖3)。

圖3 對照組與實驗組不同時期miR-126的相對表達量

2.5 脊髓損傷后HOXA9的表達

為了探討脊髓損傷后miR-126是通過何種機制來調節(jié)神經干細胞的分化,從而促進脊髓功能修復。在不同時期對脊髓損傷部位miR-126的下游靶基因HOXA9進行RT-PCR、免疫印跡檢測,所得數(shù)據(jù)顯示,脊髓損傷后HOXA9表達量早期與對照組相比明顯升高,而后逐漸下降,在21d下降最為明顯(圖4)。

圖4 對照組與實驗組不同時期HOXA9 mRNA (A)及蛋白質(B)的相對表達量

圖1 對照組與實驗組不同時期脊髓損傷部位的H-E染色(A1～G1)和尼氏染色(A2～G2),標尺=100μmFig 1 H-E staining(A1-G1) and Nissl s staining (A2-G2) of spinal cord injury at different periods in the control and the experimental groups. Bar=100μmA: Control group; B: SCI 1d; C: SCI 3d; D: SCI 7d; E: SCI 14d; F: SCI 21d; G: SCI 28d

2.6 miR-126、HOXA9、nestin、尼氏體的相關性分析

結果(表2)顯示miR-126與nestin、尼氏體呈正相關,與HOXA9呈負相關。HOXA9與miR-126、nestin、尼氏體呈負相關。

表2 miR-126、HOXA9、nestin、尼氏體相關性分析(r)

*P<0.05,**P<0.01

3 討論

脊髓損傷是一種嚴重的創(chuàng)傷性疾病,多因創(chuàng)傷導致局部神經組織、細胞變性壞死以及脊髓神經連續(xù)中斷,從而引起損傷平面以下感覺、運動及自主神經功能障礙。神經元的受損部位是引起脊髓功能障礙的主要因素,如何促進受損部位神經元的再生,已成為近期研究的熱點。目前,在治療脊髓損傷的眾多方案中,神經干細胞治療是最有前途的治療方案之一[5]。神經干細胞具有自我更新、增殖、遷移、定向分化的潛能,其分化的神經元可替代壞死丟失的神經元并與周圍正常神經元形成新的突觸,重建傳導通路[8]。神經干細胞治療主要有2種方式： (1) 應用外源性神經干細胞進行移植;(2) 誘導內源性神經干細胞增殖、分化。由于外源性神經干細胞的來源、免疫排斥以及倫理等問題制約其臨床應用[9-10],因此,如何誘導內源性神經干細胞增殖、分化成為近期研究的熱點。

miR-126是眾多microRNAs中的一種類型,其在血管內皮細胞中高度富聚[17],能與靶基因的mRNA特異性結合，在轉錄后發(fā)揮調控作用;作為一種調控基因,參與細胞的生長增殖、分化、凋亡等多種生物進程的調控[18]。以往的研究表明miR-126在維持血管的完整性方面發(fā)揮著重要的作用,并且在胚胎發(fā)育過程中及損傷后促進血管生成[19-21]。近期Hu等[22]報道在脊髓損傷后上調miR-126表達,其通過調控SPRED1、PIK3R2和VCAM1 3個靶基因的mRNA和蛋白質的表達,促進血管新生和減弱炎癥損傷,促進脊髓功能修復。Zhang等[13]在體外神經干細胞培養(yǎng)過程中顯示miR-126能夠促進神經干細胞生長增殖并抑制其凋亡。易松敏等[23]報道將脊髓源性神經干細胞誘導分化為膽堿能神經元后,定量檢測分化前、后miR-126的表達變化,結果顯示在分化后的膽堿能神經元中miR-126的表達明顯高于未分化的神經干細胞。Wei等[24]在神經干細胞與運動神經元miRNA差異表達分析中也證實miR-126在運動性神經元中的表達水平顯著高于神經干細胞。這表明miR-126在神經干細胞生長增殖及分化過程中發(fā)揮著重要調控作用。而在體內miR-126是否也同樣具有促進神經干細胞生長增殖和分化的作用,尚未見報道。本實驗結果顯示，脊髓損傷急性期miR-126表達量和神經干細胞數(shù)量明顯下降,同時尼氏體也大幅度減少甚至消失；進入亞急性期后,隨著miR-126 表達量升高,神經干細胞及尼氏體也逐漸增多。因此,推測在體內miR-126對神經干細胞的生長增殖和分化也具有一定的調節(jié)作用。

雖然miR-126在神經干細胞向神經元生長增殖、分化過程中具有重要調控作用,但其具體作用機制尚未見詳細報道。Wei等[24]在3種靶基因預測程序中檢測到HOXA9是miR-126的下游靶基因,miR-126對其有負向調控作用。因此,本次實驗又對HOXA9進行了檢測,結果顯示在miR-126表達量較低時HOXA9的表達量顯著升高,而尼氏體數(shù)量減少；隨著miR-126的逐漸升高,HOXA9出現(xiàn)下降趨勢,同時尼氏體數(shù)量也逐漸增加,運動功能也得到一定的恢復。經統(tǒng)計學分析顯示，HOXA9表達與miR-126表達及尼氏體數(shù)量呈負相關,miR-126與神經干細胞和尼氏體數(shù)量呈正相關。據(jù)報道,人類的HOX基因共有39個,分布在4個染色體組。通過HOX基因同源盒序列的比較顯示,只有HOXA9包含miR-126的結合位點[25]。Shen等[26]報道m(xù)iR-126在HOXA9同源盒上的靶點高度保守,miR-126可以通過降解HOXA mRNA來下調HOXA9蛋白水平。而Hox蛋白又是脊髓運動神經元定性和組成的重要決定因素[27],因此,推測miR-126可能在促進神經干細胞生長增殖的同時也可通過負向調控HOXA9表達,提高神經干細胞向神經元分化的比例,進而促進受損脊髓神經功能的修復。一種基因可以調控多種細胞的生長增殖、分化,同時一種細胞也受多種基因調控。在本次實驗中僅觀察到miR-126在治療脊髓損傷過程中,可能在促進神經干細胞生長增殖的同時，通過負向調節(jié)HOXA9來提高其向神經元的分化,但這只是其中的一小部分,在此過程中也可能有其他因素的共同參與。