廣西百色地區(qū)人群S100B基因rs2839356和rs881827多態(tài)性?

陸玉蘭 王 榮 黃華佗 覃海媚 劉純宏 羅宏成 韋葉生

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科, 百色 533000)

星形膠質(zhì)源性蛋白S100B為S100蛋白家族中的重要成員之一,由α和β兩種亞基組成,分子量為21kD[1]。S100B廣泛分布于星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、室管膜細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、皮膚朗格漢斯細胞、淋巴細胞亞群、肌衛(wèi)星細胞等[2]。S100B是一種具有多種生物學活性的蛋白質(zhì),如參與細胞的增殖與分化,調(diào)節(jié)細胞的凋亡,參與細胞間信號轉(zhuǎn)導以及調(diào)節(jié)鈣離子的平衡等。此外,S100B蛋白可通過與晚期糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合后激活轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)及p38MAPK 等信號通路,誘導炎癥因子的活性,從而導致膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的應(yīng)激與凋亡[3-4]。既往研究表明,S100B蛋白在缺血性腦卒中、黑色素瘤、創(chuàng)傷性腦損傷和自閉癥等疾病中扮演重要的角色[5-8]。然而,人們對S100B的研究主要集中在血清水平,關(guān)于S100B基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性的研究還比較少。本研究通過分析S100B基因多態(tài)性位點基因型和等位基因頻率在廣西百色地區(qū)人群中的分布,并與Hap Map數(shù)據(jù)庫公布的4個人群S100B基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism， SNP)分型數(shù)據(jù)進行比較,探討S100B基因多態(tài)性在不同地區(qū)種族人群中的分布差異,為深入研究S100B基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供重要的遺傳學理論依據(jù)和分子生物學基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

隨機選取2016年3～10月到右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院體檢的體檢者398例,其中男性231 例,女性167例,平均年齡(58.09±8.76)歲。所有研究對象均來自廣西地區(qū),且相互無血緣關(guān)系。排除腫瘤、心腦血管疾病及感染性疾病等。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會的審批。

1.2 基因組DNA提取

采集體檢者靜脈血3ml,用含有EDTA-K2抗凝劑的采血管保存。采用離心柱法進行基因組DNA提取,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計與合成

引物用在線Primer3 軟件設(shè)計(http： //bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/),并由上海天昊生物科技有限公司合成。其中rs2839356位點的上游引物序列為： 5′-TCACCTTCAGGGCAGCTGAGAA-3′,下游引物序列為： 5′-TGGAAGGGAGGGAGACAAGCAC-3′;擴增片段長度為175bp,延伸引物為： 5′-TTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTAAGATAAAGCCAGTGT ACAGATGGAT-3′;rs881827上游引物序列為： 5′-TGTGTGTGGAAGTCCCTGTCTCA-3′;下游引物序列為： 5′-CCCTGCACTGTGGTTGTTCCTC-3′;擴增片段長度為248bp,延伸引物為： 5′-TTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTGTTGCTGAAGTAACT CTTGGGAAC-3′。

1.4 PCR擴增

采用20μl反應(yīng)體系,其中包括1×GC-I 緩沖液(TaKaRa)、1μl 多重PCR引物、1 U HotStarTaq 聚合酶(Qiagen Inc.)、3.0mmol/L鎂離子、0.3mmol/L dNTP、1μl DNA模板,余下體積用經(jīng)過嚴格高壓滅菌的雙蒸水補足。PCR 反應(yīng)參數(shù)為： 95℃預變性2min;擴增階段為： 94℃預變性20s,65℃退火40s,72℃延伸1.5min,循環(huán)11次;94℃預變性20s,59℃退火30s,72℃延伸1.5min,循環(huán)24次;最后階段72℃延長2min。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得,PCR產(chǎn)物經(jīng)過蝦堿酶(SAP， Promega公司)和外切酶I(EXO I， Epicentre公司)純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用SAP純化后在ABI3730xl上樣。SNP分型用GeneMapper4.1軟件分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件包對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。兩位點基因型及等位基因頻率采用直接計數(shù)法計算;兩組間基因型及等位基因頻率的比較均采用χ2檢驗;采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗評估樣本的群體代表性。

2 結(jié)果

2.1 S100B的基因型檢測

S100B基因rs2839356和rs881827位點經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗,兩位點基因型均達Hardy-Weinberg平衡(P值分別0.202和0.902),表明本研究具有群體代表性。測序結(jié)果顯示,rs2839356和rs881827兩位點都包含TT、CT、CC 3種基因型,DNA測序法證實了該結(jié)果(圖1A、B)。

圖1 S100B基因rs2839356和rs881827測序圖

2.2 S100B基因rs2839356和rs881827多態(tài)性在廣西百色地區(qū)人群中的分布

統(tǒng)計分析表明,廣西百色地區(qū)人群中,S100B基因rs2839356、rs881827兩位點分別以TT和CT基因型多見,其頻率分別為49.2%和48.3%,以T和C等位基因分布頻率最高,各占71.1%和58.5%。兩位點各基因型和等位基因頻率在男、女兩組間分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示這兩個位點基因型和等位基因分布頻率在廣西百色地區(qū)人群中分布與性別無關(guān)(表1)。

2.3 S100B基因rs2839356和rs881827位點多態(tài)性在不同地區(qū)種族人群間的比較

廣西百色地區(qū)人群S100B基因rs2839356和rs881827位點多態(tài)性分布頻率與人類基因組單體型圖計劃(htt： //www.Hapmap.org)公布的Hap Map-CEU (Utah residents with Northern and Western European ancestry)、Hap Map-YRI (Japanese in Tokyo)和Hap Map-CHB (Han Chinese in Beijing, China)3個人群SNP分型數(shù)據(jù)進行比較,結(jié)果顯示,廣西百色地區(qū)人群rs2839356、rs881827兩位點的基因型和等位基因頻率分布與Hap Map-CEU、Hap Map-YRI和Hap Map-JPT相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與Hap Map-CHB相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2、3)。

表1 S100B 基因rs2839356和rs881827多態(tài)性在廣西百色地區(qū)人群中的分布(%)

Genotype and allele frequencies of S100B gene showed no significant difference among the same group of male and female (P>0.05)

表2 廣西百色地區(qū)人群rs2839356位點多態(tài)性分布頻率與人類基因組單體型圖計劃掃描所得的其他地區(qū)種族人群的結(jié)果比較(%)

*P<0.05vsBaise Guangxi

表3 廣西百色地區(qū)人群rs881827位點多態(tài)性分布頻率與人類基因組單體型圖計劃掃描所得的其他地區(qū)種族人群的結(jié)果比較(%)

*P<0.05vsBaise Guangxi

3 討論

3.1 研究S100B基因多態(tài)性的重要性

流行病學研究表明,遺傳背景的差異可以造成不同種族人群對于某些疾病存在不同的易感性,通過研究不同地區(qū)人群基因多態(tài)性,不僅有助于認識不同種族人群對某一疾病易感性的差異,而且對于研究某些疾病的發(fā)病機制及基因水平的診斷和治療有重要意義。因此,S100B基因多態(tài)性的研究是解釋相關(guān)疾病臨床表現(xiàn)多樣化的一個有用的方法,在對一些疾病S100B基因的多態(tài)性進行研究時,首先了解其在正常人群中的分布特點,是正確分析基因多態(tài)性與相關(guān)疾病之間關(guān)系的前提。

人類S100B的基因位于21號染色體長臂(21q22.3),由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成,其mRNA長度為1095bp,編碼91個氨基酸。S100B 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制復雜,當轉(zhuǎn)錄被抑制,需要依賴特異性反向因子才能啟動它的表達[9]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)編碼S100B基因序列中存在SNP位點,而這些多態(tài)性位點可能參與了相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展。既往研究表明,S100B基因多態(tài)性與閱讀障礙癥、精神分裂癥、自閉癥、抑郁癥和手足口病等疾病密切相關(guān)[10-14]。SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列的改變,它是人類可遺傳變異中最常見的類型,也是個體或者群體之間遺傳差異最主要的表現(xiàn)形式。SNP的研究有助于解釋不同群體和個體對疾病,特別是對復雜疾病的易感性以及對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因素反應(yīng)的表型差異?，F(xiàn)有研究表明,具有不同遺傳背景的人群,對疾病也存在不同的易感性。芬蘭學者Matsson等[10]研究表明S100B基因rs9722 T等位基因與閱讀障礙癥的發(fā)生存在相關(guān)性,而我國學者羅秀等[15]報道S100B基因rs9722的遺傳變異與閱讀障礙癥相關(guān)性無統(tǒng)計學意義,出現(xiàn)此差異的原因之一可能是兩種研究人群的遺傳背景不一樣。因此,了解S100B 基因多態(tài)性及其分布特點,可提供不同地區(qū)人群的遺傳背景資料,為進一步研究相關(guān)疾病在不同地區(qū)人群中的發(fā)病情況提供遺傳信息,同時,對認識 S100B相關(guān)疾病的發(fā)病機制和防治措施有重要的指導意義。

3.2 S100B基因多態(tài)性在廣西百色地區(qū)人群中的分布及其與不同地區(qū)人群的比較

本研究采用單堿基延伸技術(shù)和DNA 測序法檢測廣西百色地區(qū)人群S100B基因rs2839356和rs881827位點的多態(tài)性,并與Hap Map數(shù)據(jù)庫上公布的4種人群的SNP分型數(shù)據(jù)比較,結(jié)果顯示,廣西百色地區(qū)人群S100B基因rs2839356、rs881827位點在不同性別間基因型和等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計學意義,說明兩位點多態(tài)性與性別無關(guān)。與Hap Map上公布的4種不同地區(qū)種族人群SNP分型數(shù)據(jù)比較后表明,廣西百色地區(qū)人群S100B基因rs2839356、rs881827位點多態(tài)性與親緣關(guān)系最近的中國北京漢族人(Hap Map-CHB)比較差異無統(tǒng)計學意義,與親緣關(guān)系相對較遠的歐洲人(Hap Map-CEU)、非洲人(Hap Map-YRI)、日本人(Hap Map-JPT)比較差異均有統(tǒng)計學意義。本研究結(jié)果符合“親緣關(guān)系越近,其基因型分布越相似,親緣關(guān)系越遠,差異越顯著”的遺傳學規(guī)律,同時,也提示S100B基因rs2839356和rs881827位點多態(tài)性與其他地區(qū)種族人群相比存在差異。基因多態(tài)性可能因地理位置、環(huán)境、飲食和生活習慣以及種族不同而呈現(xiàn)不同程度的差異[16],而廣西是一個多民族聚集的地區(qū),地理環(huán)境獨特,生活方式與其他地區(qū)也存在較大的差異,也可能會導致基因多態(tài)性分布的差異,因此,雖然Hap Map-HCB、Hap Map-JPT人群和廣西百色地區(qū)人群同屬于亞洲人群,但這3個不同地區(qū)人群的基因型和等位基因分布頻率也表現(xiàn)出一定差異。

總之,本研究初步探討了S100B基因rs2839356和rs881827位點多態(tài)性在廣西百色地區(qū)人群中的分布特征,并分析其與不同地區(qū)種族人群的分布差異,為進一步研究群體遺傳學和預防相關(guān)疾病奠定了重要基礎(chǔ)。雖然本研究表明廣西百色地區(qū)人群S100B基因存在多態(tài)性,且與其他地區(qū)種族人群相比存在差異,但是,本研究仍存局限性,首先,研究的樣本量相對較小。其次,廣西是一個多民族聚集的地區(qū),各民族間是否有差異,需要我們進一步研究。而且,本研究所選的人群是醫(yī)院的體檢者,可能存在選擇人群的偏倚。因此,如何深入研究S100B基因在不同人群中存在多態(tài)性的機制,是本課題組今后努力的方向。