c-Jun氨基末端激酶對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞自噬的調(diào)節(jié)及依達拉奉的影響

趙雅寧 郭向飛 李建民 趙 旭 徐繼偉 薛承景

(華北理工大學, 1 康復醫(yī)學院, 2 附屬醫(yī)院神經(jīng)外科, 唐山 063000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)在腦血管疾病中大概占10%～15%,其致殘率和死亡率很高[1]。依達拉奉(Edaravone)是2000年上市的新型氧自由基清除劑,臨床上主要用于治療急性腦梗塞,可有效的防治腦水腫及腦梗塞的進展[2]。近年來有學者將依達拉奉應用于顱腦創(chuàng)傷的治療中,取得了一定效果。自噬對細胞的轉(zhuǎn)歸、恢復、修復、損傷、加重或死亡起著重要作用[3]。SAH早期發(fā)生自噬的激活,抑制自噬可加重SAH神經(jīng)功能[4]。前期研究發(fā)現(xiàn),Edaravone治療可提高 SAH后神經(jīng)元自噬的激活,但其具體作用機制尚未闡明。自噬的激活涉及多種復雜的分子機制,其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路與自噬聯(lián)系最為密切[5]。JNK是有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族重要成員之一,現(xiàn)已證實自噬和JNK信號活化在多種疾病如動脈粥樣硬化、腦卒中、神經(jīng)退行性疾病等病理過程中具有關鍵作用[6-7]。本研究建立SAH動物模型,采用依達拉奉、JNK抑制劑SP600125進行干預,觀察海馬區(qū)組織丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平、活化狀態(tài)JNK(磷酸化JNK)、自噬關鍵因子Beclin-1和微管相關蛋白1(輕鏈LC3)-Ⅱ表達變化及神經(jīng)細胞丟失變化,探討JNK對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞自噬的調(diào)節(jié)及依達拉奉的影響。

1 材料和方法

1.1 動物分組與模型制作

清潔級雄性SD大鼠160只,體質(zhì)量350～450g(購置于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證號SCXK(京)2009-003)。分為假手術(shù)組(Sham組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血模型組(SAH組)、JNK抑制劑SP600125組、依達拉奉干預組。每組分為6、24、48h和72h 4個時間亞組。

采用經(jīng)典的自體血2次枕大池注血法(間隔48h分別向枕大池注射自體動脈血0.3ml)制備大鼠SAH的模型[8]。Sham組向枕大池2次注入0.3ml生理鹽水,余操作均與SAH組一致。

SP600125組： 模型制備前30min側(cè)腦室注射SP600125試劑(美國SANTACRUZ公司,貨號： HY-12041-04752-2013),10μg/μl,注射速度為1mm/min,留針10min后,以1mm/min速度取針。依達拉奉干預組： 在模型制備后即刻經(jīng)尾靜脈注射依達拉奉(國藥準字H20110090,建天泉藥業(yè)股份有限公司),10mg/kg,每24h注射給藥1次,至72h結(jié)束。

模型成功判定標準： (1) 當行2次枕大池注血時,可見少量血性腦脊液在穿刺部位滲出,此現(xiàn)象充分說明穿刺針位置準確;(2) 剝離腦部時肉眼明顯可見血性液體散在分布在腦底基底池部位。模型制作過程中,SAH組、SP600125組和依達拉奉組因死亡或不符合標準被剔除的動物分別為7、8、8只。上述被剔除動物依次補齊,最終各組40只動物納入統(tǒng)計學分析。

1.2 腦組織海馬區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

每組各時間點取5只大鼠,常規(guī)麻醉后,處死動物,用4%多聚甲醛灌注固定后,取視交叉平面至大腦橫裂腦組織。石蠟包埋、冠狀切片,片厚5μm,H-E染色。光學顯微鏡下觀察;在400×光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化,計數(shù)該視野下的存活神經(jīng)元數(shù)量(有明顯細胞膜、細胞核、核仁為存活神經(jīng)細胞)。具體方法： 各組各時間點5只大鼠,每只大鼠取4張海馬區(qū)切片,每張切片選取5個不重復的視野(共100個視野),選Motic-6.0圖像采集以及系統(tǒng)分析,以每個視野下平均細胞百分率(400×)下CA1區(qū)存活細胞數(shù)量與總細胞數(shù)量比值%)表示。

1.3 免疫組織化學檢測磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ陽性表達

標本采集同H-E染色,切片常規(guī)脫蠟至去離子水、滴加復合消化液、加入37℃溫箱孵育20min, PBS洗滌3次,每次5min,用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15min, PBS洗滌、滴加兔抗鼠磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ多克隆抗體(1∶200,1∶200,1∶250),4℃過夜;37℃復溫45min,PBS洗滌、滴加生物素化二抗,37℃孵育40min,PBS洗滌,DAB顯色,蘇木精輕度復染、脫水透明、封片。鏡下觀察并攝片。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測磷酸化JNK、 Beclin-1、LC3-Ⅱ表達

各組各時間點取5只大鼠,按照規(guī)定的時間點處死動物后,快速斷頭取腦,用冰箱中預冷的器械在冰上分離出雙側(cè)海馬組織,稱量0.6g,加入1 ml RNAiso Plus溶液后勻漿,室溫靜置5min后12000r/min 4℃離心5min,取上清移至新的1.5ml離心管內(nèi),加入1/5 RNAiso Plus溶液體積的氯仿,震蕩混勻后室溫靜置5min,12000r/min 4℃離心15min,將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中,加入0.5～1倍RNA iso Plus溶液體積的異丙醇,室溫靜置10min,12000r/min 4℃離心10min,棄掉上清液,用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀,7500r/min 4℃離心5min,棄上清保留沉淀,干燥(不可加熱),溶解于30μl DEPC處理水中,測量OD260/280值,根據(jù)OD260計算RNA濃度,-80℃保存。

檢測步驟： (1) 磷酸化JNK,上游引物AGGGAG CACACAATAGAGGAGTG,下游引物GAAGACGA CGGATGCTGAGAG;(2) Beclin-1,上游引物CTCT CGTCAAGGCGTCACTTC,下游引物CCTTAGAC CCCTCCATTCCTCA;(3) LC3,上游引物ACCCTCT ACGATGCTGGTGA,下游引物GCTGTCCTCAATG TCCTTCTG。進行實時熒光定量PCR反應： 42℃ 50min,95℃ 10s;(95℃ 15s、56℃ 20s)×45個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因,以Sham組磷酸化JNK mRNA、Beclin-1 mRNA 和LC3-Ⅱ mRNA表達為1,計算各組磷酸化JNK mRNA、Beclin-1 mRNA 和LC3-Ⅱ mRNA 的Ct值(公式(△△Ct=目的基因平均△Ct值-管家基因平均Ct值,△△Ct=實驗組△Ct-對照組△Ct,相對表達量=2-△△Ct)。

1.5 MDA含量測定

取材方法同免疫印跡,大鼠致死后,迅速取雙側(cè)皮質(zhì)及海馬區(qū)組織,稱量0.6g,勻漿,依次加入試劑,混勻器混勻,沸水浴40min,冷卻,然后3500r/min,離心10min。取上清,532nm處,1cm光徑,蒸餾水調(diào)零,比色測定各管吸光度值,按說明計算MDA含量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學變化

Sham組海馬區(qū)神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)正常、排列整齊、胞核大而圓,核仁清晰;SAH組海馬區(qū)可見神經(jīng)細胞變性水腫、壞死神經(jīng)細胞,表現(xiàn)為細胞出現(xiàn)核溶解、核碎裂或核消失結(jié)構(gòu)不清。與Sham組比較,SAH組各時間點神經(jīng)細胞存活率均明顯減少(P<0.05);SP600125組神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷進一步減輕,視野中存活神經(jīng)細胞增多,與SAH組比較,各時間點神經(jīng)元存活率均明顯增加(P<0.05);依達拉奉組神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均減輕,視野中死亡神經(jīng)細胞減少,與SAH組比較,依達拉奉組各時間點神經(jīng)元存活率均明顯增多;依達拉奉組海馬區(qū)神經(jīng)細胞存活率高于SP600125組(P<0.05)(圖1,表1)。

表1 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞存活率比較(n=5,±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

2.2 MDA檢測

與 Sham組比較,SAH組各時間點MDA均明顯增多(P<0.05);與SAH組比較,SP600125組各時間點MDA均降低(P<0.05);與SAH組比較,依達拉奉組各時間點MDA均降低(P<0.05);依達拉奉組MDA低于SP600125組(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠海馬區(qū)MDA水平比較(n=5,±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

2.3 磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫組織化學顯色

磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ陽性表達主要位于細胞核。Sham組大鼠大腦海馬區(qū)有極少量的陽性細胞,染色較淡。與Sham組比較,SAH 組各磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫陽性反應增強,染色棕黃;與SAH 組比較,SP600125組磷酸化JNK免疫陽性反應減弱,染色變淺,Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫陽性反應增強。與SAH 組比較,依達拉奉組磷酸化JNK免疫陽性反應減弱,染色變淺,Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫陽性反應增強(圖2,表3～5)。

表3 各組大鼠海馬區(qū)磷酸化JNK陽性細胞數(shù)比較(n=5,±s,個/高倍鏡視野)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

表4 各組大鼠海馬區(qū)Beclin-1陽性細胞數(shù)比較(n=5,±s,個/高倍鏡視野)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

表5 各組大鼠海馬區(qū)LC3-Ⅱ陽性細胞數(shù)比較(n=5,±s,個/高倍鏡視野)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

圖1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的變化，H-E染色,×400。A： Sham組72h;B： SAH組72h;C： SAH組72h;D： 依達拉奉組72h.

圖2 各組大鼠海馬區(qū)JNK(A1～D1)、Beclin-1(A2～D2)和LC3-Ⅱ(A3～D3)表達情況，免疫組織化學,×400。A： 假手術(shù)組；B： SAH組；C： SP600125組；D： 依達拉奉組.

Fig 1 The morphological changes of neurons in hippocampus in each group， H-E staining, ×400. A： Sham group 72h; B： SAH group 72h; C： SP600125 group 72h; D： Edaravone group 72h.

Fig 2 The expression of JNK (A1-D1), Beclin-1 (A2-D2) and LC3-Ⅱ (A3-D3) in the hippocampal neurons among each group， Immunohistochemistry, ×400. A： Sham group; B： SAH group; C： SP600125 group; D： Edaravone group.

2.4 磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR

與Sham組比較,SAH 組各磷酸化JNK mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達水平增加(P<0.05);與SAH 組比較,SP600125組磷酸化JNK mRNA表達水平降低,Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達水平增強(P<0.05);與SAH 組比較,依達拉奉組磷酸化JNK mRNA表達水平降低,Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達水平增強(P<0.05); 依達拉奉組和SP600125組間磷酸化JNK mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表6～8)。

表6 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元磷酸化JNK mRNA表達水平(n=5,±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

表7 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元Beclin-1 mRNA相對表達水平(n=5,±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

表8 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元LC3-Ⅱ mRNA相對表達水平(n=5,±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

3 討論

本研究結(jié)果顯示依達拉奉可減輕SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞丟失,改善動物行為學障礙,說明依達拉奉對SAH大鼠有較好的保護作用。SAH后存在氧自由基連鎖反應,這種氧自由基連鎖反應不僅是SAH早期神經(jīng)細胞損傷的關鍵[9],同時加重了SAH遲發(fā)性血管痙攣;氧化應激水平與SAH損傷程度呈正相關[10],因此給予具有較強抗氧化、清除自由基作用的依達拉奉對SAH誘導神經(jīng)損傷有較好保護作用。

JNK信號被認為是介導細胞損傷的重要通路。研究顯示SAH早期JNK即可激活,激活的JNK不僅介導SAH早期神經(jīng)細胞凋亡線粒體通路,且與SAH后遲發(fā)性血管痙攣密切相關[11]。SAH模型中,應用JNK抑制劑可減少大鼠腦內(nèi)caspase-3、caspase-8以及細胞色素C等凋亡因子的表達水平,且大鼠血腦屏障破壞和腦水腫有很大程度的緩解[12]。自噬是指細胞通過溶酶體途徑對功能受損的白質(zhì)和細胞器進行識別、降解和修復的現(xiàn)象,在細胞發(fā)生應激時的生存機制中起決定性作用。研究顯示腦損傷狀態(tài)下,自噬具有“雙刃劍”作用,適度自噬激活能夠清除細胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)及受損細胞器,調(diào)節(jié)能量代謝,減輕細胞損傷程度,降低神經(jīng)細胞死亡的發(fā)生率;但過度的自噬可以促進caspase-3裂解,加重神經(jīng)細胞死亡[13]。Zhao等[14]通過改良的顱內(nèi)動脈穿刺法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,應用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤進行預處理,顯示腦組織含水量和血腦屏障滲透率進一步加劇及神經(jīng)細胞凋亡,神經(jīng)功能評分下降。本實驗結(jié)果顯示JNK抑制劑SP600125組,死亡神經(jīng)細胞數(shù)量明顯降低,Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達增高,說明JNK激活參與SAH后自噬的調(diào)節(jié)。Yan等[15]在糖尿病GK大鼠模型研究中表明,JNK信號通路可以通過介導P53的磷酸化而達到調(diào)控自噬的目的。Li等[16]研究顯示硼替佐米可以通過促進自噬而起到對頭頸部鱗癌的治療作用。本研究依達拉奉組磷酸化JNK表達減少, Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達增加,依達拉奉可抑制JNK通路激活,提高神經(jīng)元自噬水平,對SAH具有神經(jīng)保護作用。值得注意的是,本研究依達拉奉組海馬區(qū)神經(jīng)細胞存活率顯著高于SP600125組,而兩組間磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平無明顯差異,提示依達拉奉的神經(jīng)保護作用不完全依賴JNK-自噬途徑。依達拉奉是目前氧自由基清除能力最為強大的神經(jīng)保護劑,研究證實依達拉奉可調(diào)整線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,有效拮抗腦損傷后神經(jīng)細胞丟失,促進神經(jīng)恢復[17]。

綜上所述,本研究結(jié)果表明JNK的活化可降低SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞自噬水平,依達拉奉可抑制JNK活化,提高SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞自噬水平,減輕SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞損傷。本研究結(jié)果為依達拉奉在顱腦損傷救治的應用提供了一定的理論依據(jù)。