克老素在脊髓損傷中的表達(dá)及相關(guān)性分析?

楊 寧 董 彬 傅 莉 王嘉鈺 黃 煜 任麗莉 金梅花 韓東河

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 錦州 121001)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是脊柱損傷的嚴(yán)重并發(fā)癥,目前國內(nèi)外治療SCI的藥物和外科手術(shù)均未取得令人滿意的臨床療效[1-2]。脊髓損傷后數(shù)小時到數(shù)周之內(nèi),即繼發(fā)性損傷,會發(fā)生一系列神經(jīng)細(xì)胞和分子水平上的病理反應(yīng),引起細(xì)胞進(jìn)一步壞死和凋亡,最終形成髓鞘剝脫和軸突的萎縮退變[3-5]。近年來,一些研究指出,抗衰老基因克老素與神經(jīng)退行性疾病有著密切的相互聯(lián)系,可能通過抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗衰老的作用[6-8]。已知克老素基因敲除小鼠與野生型小鼠相比,表現(xiàn)為其認(rèn)知功能障礙,且認(rèn)知障礙的克老素基因敲除小鼠出現(xiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)的增加，海馬內(nèi)脂質(zhì)和DNA氧化水平顯著提高,但克老素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)以及神經(jīng)損傷中的作用及機制尚不清楚。為此,本研究將利用脊髓損傷動物模型,觀察克老素在脊髓神經(jīng)元中的表達(dá)變化,分析克老素的表達(dá)變化與神經(jīng)損傷之間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

50只清潔健康2月齡雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20) g,均由錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,動物許可證號： SCXK(遼)2003-0007。將大鼠隨機分為正常對照組(Sham)，損傷1周、2周、4周組(SCI 1 week, SCI 2 weeks, SCI 4 weeks)。

1.2 建立SCI動物模型

在腹腔注射4%水合氯醛(5ml/kg)進(jìn)行麻醉,對大鼠背部脫毛、常規(guī)消毒、鋪洞巾,將大鼠俯臥位并固定于立體定位儀上;以第9胸椎(T9)棘突為中心,尖刀背部縱行切開長2～3cm創(chuàng)口,鈍性分離皮下組織和肌肉,暴露脊柱椎骨T8～T10棘突和椎板,用咬骨鉗慢慢咬除椎板并暴露硬脊膜;用寬度1.0mm的動脈瘤夾(規(guī)格為50g力),壓迫T9～T10段脊髓1min;大鼠隨即出現(xiàn)擺尾、雙后肢和軀體抽縮撲動后,雙后肢癱瘓;觀察并止血,鹽水沖洗切口,用手術(shù)線分層縫合肌肉軟組織及皮膚,模型制作完成。模型制作完成后,立即腹腔注射37℃生理鹽水5ml以補充丟失的體液。術(shù)后24h內(nèi),注意保溫并嚴(yán)格術(shù)后觀察。術(shù)后常規(guī)護(hù)理以青霉素4×104U/d,連續(xù)5d。每天各在早晚8：00定時以膀胱按摩協(xié)助大鼠排尿,直到本實驗結(jié)束。Sham組僅打開椎板,然后縫合。

1.3 RT-PCR法檢測克老素基因的變化

根據(jù)產(chǎn)品說明書,提取組織總RNA,取約1μg總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在PCR儀上設(shè)定逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件： 37℃ 10min,42℃ 30min,70℃ 5min,4℃。取1μl 合成好的cDNA,配好PCR反應(yīng)液,進(jìn)行擴增。克老素引物序列(5′-3′)為： Forward： CAATGGCTTCC CTCCTTTAC,Reverse： AGCACAGGTTTGCGTAG TCT(450bp)。內(nèi)參GAPDH引物序列 (5′-3′)為： Forward： CTACCCACGGCAAGTTCAAT, Reverse： GGATGCAGGGATGATGTT(478bp)。PCR反應(yīng)條件： 克老素為94℃ 30s, 55℃ 40s,72℃ 1min,29個循環(huán);GAPDH為94℃30s, 55℃ 40s,72℃ 1min,29個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,并對PCR電泳條帶進(jìn)行灰度分析,以GAPDH作為內(nèi)參,根據(jù)目的基因灰度值/內(nèi)參灰度值,計算出克老素基因的相對表達(dá)量。

1.4 免疫熒光染色法觀察克老素在脊髓的表達(dá)變化

各組脊髓組織切片,經(jīng)固定、封閉后,用兔抗大鼠Klotho(1∶100,美國Abcam)4℃孵育過夜,予羊抗兔 FITC-IgG(1∶100,美國Abcam)避光室溫孵育(未行DAPI核染色), 封片劑封片后在激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss)下觀察并拍照。

1.5 蛋白印跡檢測克老素的表達(dá)變化

各組脊髓組織剪碎后加入全蛋白裂解液, 提取總蛋白,用BCA法進(jìn)行定量,將蛋白濃度最終定為0.8μg/μl，取10μg行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h;TBST洗膜,一抗Klotho(1∶500)4℃孵育過夜;洗膜3次,相應(yīng)二抗(1∶2000)室溫孵育2h,洗膜3次;暗室ECL發(fā)光顯色、曝光、拍照,Image J分析結(jié)果。

1.6 ELISA法檢測大鼠脊髓損傷后氧化損傷程度

取大鼠脊髓組織蛋白液,利用稀釋液1∶5稀釋蛋白提取液,檢測8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量,并按試劑盒說明書操作。每份樣本做2個平行樣。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓組織中克老素mRNA的表達(dá)變化

結(jié)果顯示,損傷組大鼠脊髓中克老素基因表達(dá)較假手術(shù)組低,并并隨損傷時間的延長,呈波動性改變,在損傷后1周開始減低,4周時減少到最低(圖1)。

圖1 克老素mRNA在脊髓損傷中的表達(dá)變化

2.2 大鼠脊髓組織中克老素蛋白的表達(dá)變化

免疫熒光法檢測結(jié)果顯示,克老素在脊髓神經(jīng)組織中表達(dá),且熒光強度隨病程增加,逐漸減弱(圖2)。蛋白電泳定量分析結(jié)果顯示,損傷組大鼠脊髓中,克老素蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低,并隨損傷時間的延長,呈波動性改變,在損傷后1周開始減低,4周時減少到最低(圖3)。

圖2 克老素蛋白在脊髓組織中的表達(dá),標(biāo)尺=100μm

圖3 克老素蛋白在脊髓損傷中的表達(dá)變化

2.3 大鼠脊髓組織中8-OHdG含量

結(jié)果顯示脊髓損傷組大鼠脊髓中8-OHdG表達(dá)水平較假手術(shù)組高,并隨損傷時間的延長,呈波動性改變,在損傷后1周開始增高,4周時增加到最高。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。

圖4 8-OHdG在脊髓損傷中的表達(dá)變化

2.4 克老素與8-OHdG相關(guān)性分析

克老素表達(dá)(變量X)與8-OHdG濃度(變量Y)進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩變量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.898,P<0.01,n=24)(圖5)。

圖5 克老素與8-OHdG相關(guān)性分析

3 討論

脊髓損傷后局部微環(huán)境變化的大量研究指出,氧化應(yīng)激是加劇脊髓損傷后誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的主要因素。尤其在神經(jīng)組織退化過程中小膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放促炎細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子α,白介素6等)和活性氧(ROS),在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了舉足輕重的作用[8]。這些因素不僅直接破壞脊髓組織,而且通過介導(dǎo)反應(yīng)性膠質(zhì)化阻止神經(jīng)再生抑制修復(fù),最終導(dǎo)致瘢痕形成,細(xì)胞死亡[7]。抗衰老基因——克老素,最初是由日本科學(xué)家Makoto Kuro-o在1997年研究時偶然發(fā)現(xiàn)的,后命名為Klotho基因。隨后經(jīng)研究進(jìn)一步確認(rèn),表明Klotho基因敲除鼠(KL-/-)具有類似人類衰老的表型,如個體壽命的縮短、身長及體質(zhì)量的明顯降低、動脈粥樣硬化、皮膚黏膜和肌肉的萎縮、軟組織鈣化、骨質(zhì)疏松等[9]。近年來,研究表明克老素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[12-13]。如精神認(rèn)知功能的障礙、大腦運動神經(jīng)元功能障礙、聽力異常等神經(jīng)功能障礙[10-11],但克老素在脊髓組織中的表達(dá)研究甚少。

本實驗結(jié)果表明,脊髓損傷后大鼠脊髓組織中的克老素表達(dá)較正常組及假損傷組明顯減弱,且克老素的表達(dá)隨著脊髓損傷的病理進(jìn)程逐漸減弱,提示脊髓損傷后大鼠脊髓組織中克老素參與脊髓損傷修復(fù)的病理過程。最近有研究指出克老素蛋白過表達(dá),可以明顯減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激,胞內(nèi)的凋亡分子caspase-9的活性也隨著明顯降低[14-15]。本研究結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷指標(biāo)8-OHdG的表達(dá)隨脊髓損傷的病理過程而增高,且與克老素的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示克老素可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。根據(jù)上述結(jié)果,脊髓損傷神經(jīng)元的凋亡的增加是否與克老素的表達(dá)具有直接關(guān)系,尚不清楚。因此,進(jìn)一步在體內(nèi)外實驗中利用基因過表達(dá)或沉默技術(shù),調(diào)控克老素的表達(dá),驗證克老素與大鼠脊髓中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及運動功能的改變,將具有重要的研究意義。