砷對大鼠附睪中肝細胞生長因子及其受體c-met表達與透明質(zhì)酸酶活性的影響?

戴研平 高曉勤

(1 貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院, 貴陽 550004; 2 遵義醫(yī)藥高等?？茖W校, 遵義 563006; 3 岳陽市岳陽樓區(qū)人民醫(yī)院, 岳陽 414000)

砷是一種廣泛存在于自然界的環(huán)境毒物和人類致癌物[1]。我國是深受地方性砷中毒危害的國家之一。研究表明,長期慢性砷暴露可影響人類的生殖和發(fā)育[2]。附睪微環(huán)境對精子成熟起著重要作用[3]。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一種多效性的因子,通過與受體c-Met結合后發(fā)揮多種生物學效應,能夠促進細胞的分裂、遷移和血管的生成[4]。透明質(zhì)酸酶是一種以降解透明質(zhì)酸(hyaluronidase, HYD)為主的糖苷酶。目前關于HYD及其相關研究越來越引起人們的重視[5]。研究表明精液中HYD活性降低可能是引起男性不育的病因之一[6]。關于砷中毒與HGF及HYD相關研究少見報道。本研究通過探討慢性砷中毒對大鼠HGF、c-met、精子HYD及其超微結構的影響,闡明砷造成精子HYD及精子功能改變的機制,為慢性砷中毒導致男性不育的防治提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇健康清潔級雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量160～200g,由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供,許可證號： SCK(黔)2002-0001。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度22℃～25℃,相對濕度為63%～65%。實驗期間,大鼠可自由攝食、飲水。適應性飼養(yǎng)1周后,將大鼠隨機分為4組,分別為對照組(蒸餾水)，低(2.4mg/L)、中(12.0mg/L)、高(60．0mg/L) 劑量砷染毒組,每組10只。采用自由飲用方式連續(xù)染毒6月。

1.2 標本處理

染毒結束后處死動物,無菌條件下摘取雙側(cè)附睪組織,仔細去除周圍脂肪組織及筋膜,生理鹽水快速沖洗。立即分離右側(cè)附睪尾部,放置預熱37℃磷酸鹽緩沖液(PBS)中剪碎,待精子游出,一部分用于HYD活性的檢測,另一部分用于電鏡下觀察。

1.3 主要試劑

亞砷酸鈉(As2O3,分析純,中國北京化工廠);1%鋨酸、3%戊二醛、醋酸鈾(中國北京化工廠);Epon 812環(huán)氧樹脂(沈陽市強華試劑廠);透明質(zhì)酸鈉(山東福瑞達生物化工有限公司);明膠(成都化學試劑廠);36%醋酸、醋酸鈉(成都市聯(lián)合化工試劑研究所);40%甲醛(重慶茂業(yè)化學試劑有限公司)；HGF、c-met兔抗鼠多克隆抗體(英國Abcam公司)。

1.4 免疫印跡檢測附睪組織內(nèi)HGF、c-met蛋白表達水平

每組隨機選取6只大鼠左側(cè)的附睪,按1∶5(m/V)加入裂解液,組織勻漿,冰上裂解1h,于4℃、12000r/min離心(離心半徑為4cm)15min,取上清,即為蛋白樣品,-80℃?zhèn)溆谩２捎肂CA法測定蛋白濃度。將蛋白用1×蛋白上樣緩沖液稀釋后,沸水煮5min,每孔上樣20μl,經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,取相應條帶經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2h后,加入β-actin抗體(1∶1000稀釋)和HGF、c-met兔抗鼠多克隆抗體(1∶500稀釋),4℃ 孵育過夜,TBST 緩沖液洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5000稀釋),室溫振蕩孵育1.5h,TBST洗膜后,采用化學發(fā)光法進行檢測,凝膠成像系統(tǒng)成像,采用Image-J軟件進行灰度值分析。蛋白表達結果以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白(β-actin)灰度值的比值表示。

1．5 HYD活性的檢測方法

處死大鼠,立即分離右側(cè)附睪尾部,放入預熱37℃磷酸鹽緩沖液(PBS)中剪碎,待精子游出,吸取上清液,室溫下以2000r/min(離心半徑16cm)離心2次,每次10min,并用PBS液清洗,將沉淀物懸浮于2倍以上PBS液中,放入37℃恒溫恒濕箱內(nèi)。利用HYD、雙蒸水、12%明膠溶液等制備HYD一明膠底膜片,40%甲醛中固定1h后,置于0．2mmol/L醋酸一醋酸鈉緩沖液(pH4．2)中20min,以校正pH值。取備用的PBS精子懸浮液1～2滴涂于底物膜片上,放入37℃恒溫恒濕箱中孵育3h,檢測HYD陽性率及活性強度。

1.6 掃描電鏡(SEM)樣品制備及觀察

分別取各組部分附睪尾部精子經(jīng)PBS液洗滌,以3000r/min 離心(離心半徑為4cm)10min×3次;PBS液漂洗15min×3次;將沉淀物懸浮于3%戊二醛中固定24h;1%鋨酸再固定0.5h,PBS液洗滌,離心,乙醇梯度脫水,100%的醋酸異戌酯置換乙醇10min×3次,涂片,干燥,噴金,用S-3400N掃描電鏡觀察。每個標本觀察200個完整精子,并計算精子頂體完整率(頂體完整率=頂體完整的精子數(shù)/精子總數(shù)×100%)和精子畸形率(精子畸形率=畸形精子數(shù)/精子總數(shù)×100%)。

1．7 觀察指標

1.7.1 HYD的反應陽性率 終止孵育后,每份精子孵育片于光學顯微鏡下均勻選取5、6個視野觀察200個精子的頭部,其周圍出現(xiàn)暈環(huán)者視為HYD陽性反應,計算精子HYD陽性率。

1.7.2 HYD的活性強度 采用微尺測量每個精子頭部暈環(huán)直徑的大小,計算平均反應直徑(μm),作為判斷HYD活性強度的指標。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 免疫印跡檢測正常組和砷染毒組大鼠HGF、c-met蛋白的表達

與對照組比較,各濃度砷染毒組大鼠附睪組織內(nèi)HGF、c-met蛋白表達水平均較低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);且隨著砷染毒濃度的升高,大鼠附睪組織內(nèi)HGF、c-met的蛋白的表達水平呈下降趨勢(圖1，表1)。

2.2 砷染毒前、后精子HYD活性的比較

光鏡下,對照組精子頭部出現(xiàn)明顯的暈環(huán),直徑較大,數(shù)量較多。各染毒組隨著染砷劑量的增加,暈環(huán)的直徑變小,數(shù)量減少(圖2)。對照組孵育12h后(圖2A),陽性率可達90.1%,平均反應區(qū)直徑為44.2μm2;低劑量組孵育12h后(圖2B),陽性率可達80.3%,平均反應區(qū)直徑為29.1μm2;中劑量組孵育12h后(圖2C),陽性率可達58.0%,平均反應區(qū)直徑為18.9μm2;高劑量組孵育12h后陽性率可達21.6%(圖2D),平均反應區(qū)直徑為9.5μm2。與對照組相比,低劑量組HYD陽性率、活性強度無明顯差異(P>0.05),而中、高劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著染砷劑量的升高,精子HYD陽性率和活性強度呈逐漸下降趨勢。

圖1 慢性砷染毒大鼠附睪組織內(nèi)HGF、c-met蛋白的表達

GroupHGF/β-actinc-met/β-actinControl group0.50±0.170.47±0.13Low dose group0.32±0.12*0.29±0.10*Middle dose group0.15±0.10*0.17±0.09*High dose group0.07±0.01*0.09±0.03*

*P<0. 05vscontrol

2.3 精子掃描電鏡結果

在掃描電鏡下(圖3),對照組精子形態(tài)正常,頭部呈鐮刀狀,頂體結構完整,后環(huán)無缺如,邊界清晰,邊緣整齊,可見清晰的赤道板,表面無空洞結構,頸部與頭部銜接緊密、無斷裂、精子膜完好,頂體結構正常。砷中毒各劑量組精子的頭部出現(xiàn)不同程度的變形,頂體結構不完整,出現(xiàn)腫脹破裂、顆粒黏附、頭部包膜皺縮、尾部質(zhì)膜明顯受損,甚至脫落。頸部與頭部銜接不緊密,染毒劑量越高,精子形態(tài)改變越明顯。慢性砷染毒大鼠精子頂體完整率、精子畸形率的變化見表2。

與對照組比較,低、中、高砷染毒組大鼠精子頂體完整率均較低,而精子畸形率均較高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 正常組(A)和低、中、高砷染毒組(B、C、D)的HYD陽性反應及HYD活性觀察，×400

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球約有8000萬對夫婦罹臨不育,其中40%為男性不育,其主要因素是精子功能不全[7]。頂體位于精子的頭部,頂體反應發(fā)生時,引起頂體內(nèi)十多種頂體內(nèi)酶釋放,作用于卵子透明帶,協(xié)助精子進入卵細胞,從而完成受精[8]。其中精子頂體內(nèi)的HYD與受精關系密切,在受精過程中的精卵識別、結合階段起至關重要的作用[9-10]。測定精子HYD活性是評價精子功能的指標之一。本研究采用的改良HYD-明膠底物膜法不僅能檢測慢性砷染毒大鼠精子頂體內(nèi)HYD活性,還能估計單個精子HYD活性的強弱。

圖3 慢性砷染毒大鼠精子掃描電鏡圖，×10000

GroupAcrosome intact rateSperm malformation rateControl group92.80±6.2021.73±5.75Low dose group87.25±3.56*26.60±8.20*Middle dose group75.60±6.09*35.75±6.42*High dose group63.30±6.13*43.80±7.06*

*P<0.05vscontrol group

眾所周知,慢性砷中毒能夠引起導致男性不育。砷染毒后精子超微結構的改變主要在頂體。本研究改良透明膜底物法顯示,與對照組相比,砷染毒低劑量組HYD陽性率、活性強度無明顯差異,而中、高劑量組顯著下降。由于HYD活性降低,會導致精子溶解卵丘細胞外基質(zhì)的能力減弱,不利于精子穿過卵丘,引起精子與卵細胞結合能力減弱,阻礙受精,影響生育能力,最終會導致體外受精的成功率也不高。

HGF是一種多效生長因子,它的生物學活性是由原癌基因c-met編碼的受體蛋白介導實現(xiàn)的,HGF與c-met受體結合后可引起一系列化學反應,最終激活多條信號轉(zhuǎn)導通路[11]。研究表明,HGF具有修復組織損傷、促進細胞分化、促血管生成的作用,通過抑制caspase-3的表達或誘導抗凋亡分子的產(chǎn)生,從而發(fā)揮抗凋亡的作用[12]。c-met廣泛表達于人類和嚙齒類動物的生精細胞[13]。HGF-c-met信號通路通過影響內(nèi)分泌信號參與生精細胞凋亡的調(diào)控[14-15]。

研究表明精子結構異常嚴重影響正常受孕,甚至可導致男性不育[16]。附睪是精子成熟、儲存和獲能的場所,該部分細胞易受外界各種有害物質(zhì)影響[17]。本研究免疫印跡檢測結果顯示砷染毒各組大鼠附睪HGF、c-met蛋白表達水平均顯著下降,說明砷可能通過抑制HGF及其受體c-met的蛋白表達水平,從而干擾HGF/c-met信號通路,引起大鼠附睪及精子HYD或功能的異常。

頂體是精子頭部的重要組成部分,頂體結構發(fā)生異常最終會導致男性的生育能力下降[18]。精子質(zhì)膜在精子信息傳遞、頂體反應和精卵結合中發(fā)揮重要作用[19]。本研究結果顯示,與對照組比較,砷染毒各劑量組大鼠精子頂體完整率下降,而精子畸形率升高,差異均有統(tǒng)計學意義。說明砷染毒可使頂體內(nèi)HYD流失減少,導致精子獲能和頂體反應異常,從而影響精子受精,這也為本實驗改良底物膜法檢測慢性砷中毒使得精子HYD活性下降的結果提供了依據(jù)。

總之,本研究表明,慢性砷染毒大鼠HGF及c-met受體蛋白的表達減少并伴隨精子HYD 活性下降,頂體完整率下降和精子畸形率升高,原因可能是砷作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[20],能夠影響附睪微環(huán)境形成,通過影響HGF及其受體c-met的蛋白表達和頂體內(nèi)HYD的活性,進而影響精子的結構和功能。這些均可能通過影響精卵識別位點,使精子與透明帶結合能力下降,進而導致男性不育,但其具體機制有待進一步研究。