銅綠假單胞菌亞胺培南異質性耐藥的機制

吳婷婷， 芮志蓮， 徐敏， 邵啟祥

(1. 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 溧陽市人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 常州 213300)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P．aeruginosa)廣泛分布于自然界、人和動物的體表及腸道中，是一種常見的條件致病菌。銅綠假單胞菌在一般情況下不對健康人群致病，但對于免疫力低下或者缺陷的患者，容易引起嚴重的感染，甚至危及生命。銅綠假單胞菌同時也是院內獲得性感染的重要病原體，由該菌引起的感染約占院內感染的10%。在燒傷和腫瘤等特殊病房，以及各種導管與內窺鏡的治療與檢查室內，銅綠假單胞菌的感染率可高達30%。由于廣譜抗生素的濫用，銅綠假單胞菌對包括碳青霉烯類在內的多種抗生素的敏感性日益下降[1]。近年來甚至出現了泛耐藥的銅綠假單胞菌菌株，它們對除多黏菌素外的抗生素廣泛耐藥，包括青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類和碳青霉烯類。除了常見的耐藥種類外，近年來，研究者還發(fā)現了一種新的耐藥方式，即異質性耐藥，如對亞胺培南(imipenem，IMP)異質性耐藥的銅綠假單胞菌。臨床治療常依賴于藥敏試驗，然而仍有一部分會治療失敗，這除了與藥代動力學因素相關，也可能與細菌的異質性耐藥相關[2]。目前對異質性耐藥銅綠假單胞菌的特征及機制研究較少，本研究對常州地區(qū)臨床分離的銅綠假單胞菌及其亞胺培南異質性耐藥的機制進行了初步的探討，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

自2013年12月到2017年7月間，從蘇州大學附屬常州腫瘤醫(yī)院和溧陽市人民醫(yī)院采集的臨床患者痰液、血液、膿液等各類標本共4 207例，從中分離獲得310株銅綠假單胞菌。

1.2 試劑

血平板、生理鹽水、青島海博生物生產的250 g MH瓊脂粉、默沙東公司生產的亞胺培南-西司他丁鈉藥用針劑、金壇中天生物醫(yī)藥有限公司提供的10 μg亞胺培南紙片，500 mmol/L的EDTA溶液、反轉錄試劑盒(Cat, AORT-0020，美國Gene Copoeia公司)，1%結晶紫溶液等(批號：416112，珠海貝索生物技術有限公司)。

1.3 菌譜分析及生物學特性觀察

將ATCC27853標準菌株(溧陽市疾控中心朱偉贈送)及篩選分離的試驗菌株轉種于血平板，35 ℃孵育24 h，用無菌生理鹽水分別稀釋成106、107、108、109、1010CFU/mL等不同濃度的菌懸液。取每個濃度菌懸液10 μL，分別涂布接種于含4、8、16、32和64 μg/mL 亞胺培南的培養(yǎng)基上，35 ℃孵育48 h，然后進行菌落計數，計算耐藥亞群出現頻率并觀察菌落形態(tài)及色素產生情況。

菌譜分析的結果計算方法:細菌總量=n×100/1010，其中n為10 μL菌液(濃度為1010CFU/mL)接種于不同濃度的亞胺培南培養(yǎng)基上形成的菌落數(CFU)，乘以100將μL換算成mL，除以1010為每mL菌液中的細菌總量(CFU)。

1.4 金屬β-內酰胺酶(MBL)表型的篩選

按照紙片擴散法標準程序制備0.5麥氏單位菌液，并均勻涂布于MH瓊脂平皿上，貼含10 μg的亞胺培南藥敏紙片兩片，其中一片加入10 μL濃度為500 mmol/L的EDTA，37 ℃溫箱孵育18～24 h后測量兩紙片的抑菌圈直徑。加入EDTA的亞胺培南藥敏紙片抑菌圈直徑比不加EDTA的亞胺培南藥敏紙片抑菌圈直徑增大≥5 mm以上者為MBL表型陽性。

1.5 實時定量PCR檢測細菌外排泵基因

將單個銅綠假單胞菌菌落接種于2 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，然后用0.1% DEPC水洗滌，4 ℃離心10 min，去上清液。加入1 mL細菌裂解液裂解細菌。采用Trizol法，抽提細菌總RNA，并進行D(260/280 nm)值測定。采用反轉錄試劑盒進行反轉錄，反應總體積為50 μL，包括：總RNA 4 μg；隨機引物100 ng；5×反轉錄緩沖液8 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNasin(RNA蛋白酶抑制劑)50 U，M-MuLV反轉錄酶30 U。反應條件和時間：37 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。采用SYBGreen實時定量PCR法測定外排泵蛋白MexAB和MexCD的基因。按照試劑公司提供的操作指南進行，反應體系：緩沖液2.5 μL，上、下游引物各12.5 pmol/L，核酸模板1.0 μL，Taq酶2.5 U，總反應體系20 μL。同時設置空白對照和16 S rRNA質控對照。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。加樣完成后，在ABI7300型儀器上進行擴增。兩種外排泵的PCR反應參數為95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，58 ℃ 8 s，72 ℃ 18 s，40個循環(huán)。將檢測的臨界點設定在PCR 擴增過程中熒光信號由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環(huán)數(threshold cycle, Ct)值處, 將不同濃度的定量模板的對數和相應Ct值作圖，做標準曲線。

表1 目的基因引物序列

1.6 半定量結晶紫染色法檢測生物膜

向96孔板加入定量的菌液、肉湯和引導片，培養(yǎng)1 d后室溫下用消毒后移液管加入無菌生理鹽水漂洗3次，固定后自然干燥，然后加入1%結晶紫染液染色，20 min后漂洗脫色干燥，放入酶標儀在490 nm處測定D值。同法分別測定實驗菌株與對照株在培養(yǎng)1、3、5和7 d后的D值，以此來證實生物膜隨時間生長的厚度變化。對照菌株為隨機選擇的36株對亞胺培南完全敏感的銅綠假單胞菌。

1.7 PCR檢測膜孔蛋白OPRD2基因

OPRD2基因引物序列如下，P1：5′-TGTAGATAACTACGATACGGGAG-3′,P2：5′-GCGGTAATTTAACCA-3′，退火溫度53 ℃，產物長度193 bp。反應體系： P1、P2 引物各1 μL,Taq酶10 μL,緩沖液7 μL，模板液各1.0 μL，總反應體系20 μL。PCR 擴增的反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 60 s，53 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)35次,72 ℃ 5 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并照相保存。PCR產物送上海生工生物技術有限公司進行測序，并將測序結果與基因庫進行序列比對分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用配對資料t檢驗分析36株亞胺培南異質性耐藥與36株亞胺培南敏感銅綠假單胞菌的MexAB和MexCD的表達差異及兩組細菌生物膜產生水平的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藥敏鑒定結果

在亞胺培南紙片抑菌環(huán)的邊緣出現了許多菌落(透射光下肉眼可見)，可初步認為這些菌落可能是異質性耐藥菌落(圖1)。

圖1 銅綠假單胞菌對亞胺培南的異質性耐藥現象

根據VITEK藥敏結果，共發(fā)現244株亞胺培南敏感菌株和66株非敏感菌株。由于異質性耐藥菌株只出現在敏感菌株中，故在244株亞胺培南敏感的分離菌株中采用KB法篩選，發(fā)現有61個菌落存在異質性耐藥現象，經過5次傳代培養(yǎng)，有25株恢復敏感，同時仍有36株保持耐藥。由此確認36株對亞胺培南有異質性耐藥，總體檢出率為11.6%。菌譜分析結果見表2，銅綠假單胞菌對于亞胺培南異質性耐藥的變異頻率約在 8.9×10-7～4.5×10-9之間。

表2 菌譜分析

續(xù)表2

2.2 異質性耐藥銅綠假單胞菌不表達MBL

雙紙片協(xié)同試驗顯示，36株亞胺培南異質性耐藥的銅綠假單胞菌均不產生MBL。

2.3 外排泵基因高表達于異質性耐藥銅綠假單胞菌菌株

定時定量PCR顯示，MexAB和MexCD基因在對照菌株中的Ct值分別為15.15±0.64和14.86±1.01。而在36株亞胺培南異質性耐藥的銅綠假單胞菌中，MexAB和MexCD的Ct值分別為18.91±3.87，14.54±0.92。這表明MexAB在亞胺培南異質性耐藥銅綠假單胞菌中的表達水平明顯高于亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌(t=5.249,P<0.05)，但MexCD外排泵基因表達在兩類銅綠假單胞菌間無明顯差異(t=1.177,P>0.05)。

2.4 異質性耐藥菌株生物膜明顯高于對照菌株

由表3可見，異質性耐藥銅綠假單胞菌的生物膜形成明顯高于對照組水平(P<0.05)。

表3 半定量結晶紫染色法實驗結果 D值

2.5 OPRD2基因檢測結果

如圖2所示，3號、6號、7號均為基因缺失株。在36株異質性耐藥銅綠假單胞菌中共檢出膜孔蛋白OPRD2基因缺失株6株，陽性率為16.7%。

M：DNA標準參照物；A：銅綠假單胞菌ATCC27853；N：陰性對照大腸埃希菌ATCC25922；P：陽性對照(上海生工提供)；1-7：1-7號菌株

圖2部分膜孔蛋白OPRD2缺失菌株擴增結果電泳圖

3 討論

異質性耐藥是一種特殊類型的細菌耐藥，常導致臨床檢測錯誤和臨床抗感染治療的失敗，因而引起了學者們和臨床工作者的廣泛關注。早期關于異質性耐藥的報道見于葡萄球菌[3]，1997年，日本學者首次從傳染病患者痰液標本中分離出1例對甲氧西林異質性耐藥的金黃色葡萄球菌[4]。迄今，已有國家報道了多例萬古霉素異質性耐藥的金黃色葡萄球菌[5]，還有碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌[6]。近些年研究表明，鮑曼不動桿菌對多黏菌素和碳青霉烯類[7]，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類[8]都能發(fā)生異質性耐藥。歐洲國家也發(fā)現了碳青霉烯異質性耐藥的陰溝腸桿菌和肺炎克雷伯菌[9-10]。但相對于葡萄球菌，國內外對于銅綠假單胞菌的異質性耐藥研究較少，且耐藥機制不夠明確。

本次研究中，我們采用KB法在244株敏感菌株中檢測到61株可疑亞胺培南異質性耐藥菌株，經過5代傳代后，有25株恢復了敏感，其余36株仍然耐藥，表明部分銅綠假單胞菌菌株的異質性耐藥是不穩(wěn)定的。另外，本研究也表明，銅綠假單胞菌對于亞胺培南的異質性耐藥頻率介于8.9×10-7～ 4.5×10-9。許磊[11]研究發(fā)現銅綠假單胞菌對多黏菌素的異質性耐藥率為2×10-6～ 3.5×10-7，大大高于本研究中亞胺培南的異質性耐藥概率。美國的Hawley等[12]發(fā)現鮑曼不動桿菌對多黏菌素異質性耐藥亞群的出現頻率為2.11×10-6～ 5.3×10-7。由此可見，碳青霉烯類藥物不易產生異質性耐藥，仍應作為治療銅綠假單胞菌的首選類藥物。我們的研究闡明了銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物產生異質性耐藥的部分機制。

據文獻報道[13-16]，銅綠假單胞菌多藥耐藥的機制主要有外排泵、生物膜和產酶的作用。我們的研究發(fā)現在36株對亞胺培南耐藥具有異質性的銅綠假單胞菌菌株中，除了外排泵高表達外，生物膜形成量明顯高于對照組。但不同于一般耐藥，異質性耐藥菌株均未檢出MBL，因此銅綠假單胞菌對亞胺培南異質性耐藥的機制可能與MexAB外排泵的高表達及生物膜有關。也可能正是由于MexAB外排泵的高表達，銅綠假單胞菌能將藥物泵出菌膜，或者生物膜的出現阻止了藥物的進入，從而產生耐藥。在36株異質性耐藥菌株中檢出了6株膜孔蛋白OPRD2缺失菌株。有研究顯示96.5%的碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌株存在OPRD2編碼基因的缺失或插入，導致99.3%的菌株對亞胺培南耐藥[17]。Fernández-Cuenca等[18]指出blaADC-29、I-SAba1、ISAba2 和 ISAba3也與碳青霉烯類表型異質性耐藥的形成有關。

總之，銅綠假單胞菌的異質性耐藥的機制可能與外膜孔蛋白缺失、外排泵的作用以及生物膜的產生有關。加強對異質性耐藥細菌的檢測，能更好地指導臨床上抗生素的應用。但本次研究篩選到的異質性耐藥菌株較少，還需要擴大樣本進一步研究，以較為全面地了解銅綠假單胞菌分離株異質性耐藥特性及產生機制，從而減少因該類菌株引起的臨床藥敏檢測錯誤，避免臨床抗感染治療的失敗和院內感染的發(fā)生。