普通小麥 TaTFL1基因的克隆及表達(dá)特性研究

何慶夢(mèng)，高 翔,2，楊明明,2，董 劍,2，李曉燕,2，趙萬(wàn)春,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.陜西省小麥工程技術(shù)研究中心/陜西省小麥新品種培育工程研究中心，陜西楊凌 712100)

小麥產(chǎn)量由單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重構(gòu)成。由于受品種遺傳特性和壞境條件的制約，粒重的增加幅度相對(duì)有限；而穗粒數(shù)的變異相對(duì)較大，所以通過(guò)提高穗粒數(shù)來(lái)提高小麥單產(chǎn)的潛力大于通過(guò)增加粒重的潛力[1]。而穗粒數(shù)的形成主要取決于每穗分化小穗數(shù)、每穗分化小花數(shù)和分化小花的結(jié)實(shí)數(shù)，其中每穗實(shí)際分化的小穗數(shù)對(duì)穗粒數(shù)的形成具有重要意義。前人在對(duì)控制小穗數(shù)基因的研究中發(fā)現(xiàn)， Photoperiod-1( Ppd-1)基因能夠通過(guò)抑制FLOWERINGLOCUST(FT)基因的表達(dá)來(lái)增加小麥穗粒數(shù)[2]。而擬南芥 Terminal Flower 1(TFL1)與FT基因也表現(xiàn)出了明顯的相互抑制，在擬南芥和水稻等植物中過(guò)表達(dá) TFL1及其同源基因也表現(xiàn)出了成花數(shù)的增加[3-4]。由于 Ppd-1與 TFL1基因都能抑制FT基因的表達(dá)，因此 TaTFL1也可能對(duì)小麥的穗部發(fā)育及其小穗數(shù)的形成具有重要的作用。

迄今，對(duì) TFL1基因的研究主要是在擬南芥和水稻等模式植物中進(jìn)行。 TFL1基因在擬南芥中被首次發(fā)現(xiàn)，Shannon等[5]通過(guò)對(duì)擬南芥進(jìn)行EMS誘變，得到了頂端成花的 tfl-1( terminal flowerl-1)突變體，該突變體提早開(kāi)花，花序發(fā)育受到抑制，且花序被頂花和1～2個(gè)側(cè)花所組成的花序結(jié)構(gòu)所終止。TFL1被認(rèn)為在莖端阻止接受LEAFY(LFY)、APETALA1(AP1)傳導(dǎo)的信號(hào)，又或是延遲LFY、AP1的上調(diào)，以此來(lái)抑制LFY、AP1的活性，形成合適的花序結(jié)構(gòu)；LFY、AP1則在花分生組織頂端的外圍抑制 TFL1的轉(zhuǎn)錄，形成并維持花分生組織的特性[6-8]。在對(duì)黑麥草的研究中發(fā)現(xiàn)， LpTFL1基因在除成熟的種子外的組織中都有表達(dá)，并受到溫度與長(zhǎng)日照的調(diào)控[9]。另外，長(zhǎng)日照條件也能誘導(dǎo) TFL1在植株的營(yíng)養(yǎng)頂端分生組織中產(chǎn)生較弱水平的表達(dá)，隨后其表達(dá)開(kāi)始逐漸增強(qiáng)[12]。而水稻中的4個(gè) TFL1同源基因則分別表現(xiàn)出不同的時(shí)空表達(dá)模式，且有3個(gè)基因主要在次級(jí)分生組織中表達(dá)， Oscen1基因在各時(shí)期各組織中都有微弱的表達(dá)；而 Oscene2在根和黃化苗中的表達(dá)量較強(qiáng)； Oscen3在除葉片外的其他組織表達(dá)量較高； Oscen4基因在葉片和葉鞘中未檢測(cè)到表達(dá)，而在根部與黃化苗中表達(dá)強(qiáng)烈，在花序和幼苗中表達(dá)較弱[11]。Serrano等[3]對(duì)擬南芥 TFL1的5′和3′端的順式調(diào)控元件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)是基于不同的順式調(diào)控區(qū)，且3′端的編碼序列對(duì) TFL1的表達(dá)最為重要。Guan等[12]在探究激素對(duì)擬南芥花序發(fā)育影響的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素可能通過(guò)誘導(dǎo)分生組織特征基因 TFL1的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)擬南芥花序的形態(tài)建成及發(fā)育過(guò)程，表明激素也參與調(diào)控 TFL1基因的表達(dá)。這些研究表明， TFL1及其同源基因的表達(dá)受諸多因素的影響，在不同植物中存在一定的表達(dá)模式差異。

TFL1及其同源基因在植物開(kāi)花及花序結(jié)構(gòu)的發(fā)育中具有重要的作用，且該基因控制植物開(kāi)花和花序結(jié)構(gòu)的機(jī)制可能相對(duì)保守[13]。但小麥中尚未見(jiàn)到對(duì)該基因的表達(dá)特征的相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過(guò)克隆小麥第五同源群上 TaTFL1部分同源基因，并利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其序列組成、結(jié)構(gòu)特征及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行初步分析，對(duì)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)一步運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)分析 TaTFL1在小麥不同組織中的表達(dá)特征，以期為進(jìn)一步探究該基因的功能機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

普通小麥中國(guó)春(CS)由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室提供，部分種子在室內(nèi)培養(yǎng)，在種子萌發(fā)后的2、5和10 d分別收集幼根和葉片，并用液氮處理后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)以室內(nèi)培養(yǎng)的中國(guó)春的幼苗為材料，采用CTAB法提取基因組DNA。部分中國(guó)春的種子種植于田間，自小麥種植后分別采集1～2 cm、2～4 cm、4～5 cm和5～6 cm幼穗，同時(shí)采集花前穗下莖、穎殼和旗葉以及花后5、10和15 d的穗下莖、穎殼、籽粒和旗葉，用液氮速凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

RNA的提取按照RNAprep Pure Plant Kit(天根，北京)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA的完整性，使用NanoDropTMOne(Thermo Scientific，美國(guó))測(cè)定RNA的濃度。然后根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈。

1.3 TaTFL1基因及其啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已公布的擬南芥 TFL1基因(GenBank登錄號(hào)：NM_120465.3)序列在Ensembl plants(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Tools/Blast?db=core)進(jìn)行在線比對(duì)，利用比對(duì)的最優(yōu)結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以中國(guó)春gDNA及cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系與程序參考2×Es Taq MasterMix(康為世紀(jì)，北京)說(shuō)明書(shū)，其中循環(huán)數(shù)為30，退火溫度為62 ℃，延伸時(shí)間為5 min。PCR產(chǎn)物回收后與克隆載體pEASY-T1(全式金，北京)連接，轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序，測(cè)序所得結(jié)果使用NCBI-BLASTN(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)及DNAMAN 5.0進(jìn)行序列比對(duì)分析。

在Ensembl plants中搜索得到 TaTFL1基因5′端上游2 500 bp大小的序列，并根據(jù)其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物TP-F和TP-R(表1)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系與程序參考2×Es Taq MasterMix(康為世紀(jì)，北京)說(shuō)明書(shū)，其中循環(huán)數(shù)為30，退火溫度為60 ℃，延伸時(shí)間為2 min。利用Promoter 2.0 Prediction Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)在測(cè)序結(jié)果中預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域，再利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行順式調(diào)控元件分析。

1.4 TaTFL1基因的生物信息學(xué)分析

首先將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI-ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，預(yù)測(cè) TaTFL1基因的ORF，利用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域。然后，利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)預(yù)測(cè)基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步，利用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)、Cell-PLoc 2.0( http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)、CBS-SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和CBS-ProtFun(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)等分別預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、疏水性、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽及功能；利用NCBI-BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=Blast Search&LINK_LOC=blasthome)對(duì)所得序列進(jìn)行同源搜索，獲得不同植物中TFL1同源蛋白序列及其登錄號(hào)，再通過(guò)DNAMAN 5.0和MEGA 6.0等軟件對(duì)TaTFL1同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)及NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，bootstrap值設(shè)置為1 000，其他均采用軟件默認(rèn)參數(shù)。

1.5 TaTFL1基因表達(dá)分析

由于 TaTFL1基因三個(gè)部分同源基因序列的一致性很高，因而未能設(shè)計(jì)出針對(duì)每一個(gè)基因組進(jìn)行熒光定量的引物，而是根據(jù)三者共同的保守序列設(shè)計(jì)了共同的熒光定量引物，為避免cDNA中有未除盡的基因組DNA的干擾，熒光定量引物按照跨兩個(gè)外顯子區(qū)進(jìn)行設(shè)計(jì)，以小麥Actin基因(GenBank登錄號(hào)：AB181991.1)作為內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表1。在ABI 7300 Plus Real Time PCR System(ABI，美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR，體系與程序按照SYBR○RPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，日本)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中循環(huán)數(shù)為40，退火溫度為60 ℃，退火時(shí)間為30 s。每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)及3次技術(shù)重復(fù)，利用 2-ΔΔCT法[14]計(jì)算 TaTFL1基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 本研究所用的引物信息Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)春 TaTFL1基因的獲得及序列特征的初步分析

通過(guò)在NCBI中搜索 TFL1基因，獲得了擬南芥 TFL1基因的mRNA，將此序列在Ensembl plants中與小麥基因組序列進(jìn)行比對(duì)，獲得5AL、5BL和5DL上的 TaTFL1基因。以中國(guó)春的gDNA和cDNA為模板，同樣以 TaTFL1-F1/ TaTFL1-R1和 TaTFL1-F2/ TaTFL1-R2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別從gDNA和cDNA中擴(kuò)增得到1 200 bp和520 bp左右的目的條帶(圖1A)。

M：Trans 2K DNA marker；1： TaTFL1-5A和 TaTFL1-5B cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物； 2： TaTFL1-5D cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物； 3： TaTFL1-5A和 TaTFL1-5B gDNA擴(kuò)增產(chǎn)物； 4： TaTFL1-5D gDNA擴(kuò)增產(chǎn)物； 5： TaTFL1啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物M:Trans 2K DNA marker; 1:The amplicon of TaTFL1-5A and TaTFL1-5B from cDNA; 2:The amplicon of TaTFL1-5D from cDNA; 3:The amplicon of TaTFL1-5A and TaTFL1-5B from gDNA; 4:The amplicon of TaTFL1-5D from gDNA; 5:The amplicon of TaTFL1 promoter.

將本研究中所獲得的3條序列分別命名為 TaTFL1-5A、 TaTFL1-5B和 TaTFL1-5D，并提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，得到的序列登錄號(hào)分別為MF805802.1、MF805803.1和MF805804.1。GSDS預(yù)測(cè)結(jié)果表明， TaTFL1-5A、 TaTFL1-5B和 TaTFL1-5D與其他物種的 TFL1同源基因都具有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，三者之間只在第一外顯子和第二外顯子處存在少量的堿基數(shù)量差異。將 TaTFL1-5A、 TaTFL1-5B和 TaTFL1-5D的CDS序列及其預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相互比對(duì)發(fā)現(xiàn)彼此之間只存在個(gè)別堿基的差異，且大部分堿基差異并未引起氨基酸的改變，除了第190位的堿基差異使與之對(duì)應(yīng)的第64位氨基酸殘基在TaTFL1-5D蛋白中表現(xiàn)為M(甲硫氨酸)而TaTFL1-5A與TaTFL1-5B為L(zhǎng)(亮氨酸)(圖2B)。

2.2 TaTFL1基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

利用NCBI-ORF Finder對(duì) TaTFL1基因的ORF進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn) TaTFL1-5A、 TaTFL1-5B和 TaTFL1-5D均含有一個(gè)522 bp的ORF，編碼173個(gè)氨基酸。使用NCBI-CDD對(duì) TaTFL1基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TaTFL1-5A、TaTFL1-5B和TaTFL1-5D都具有典型的BEBP家族結(jié)構(gòu)域(圖3)。由ExPASy-ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果可知， TaTFL1基因編碼蛋白為不穩(wěn)定蛋白。ExPASy-ProtScale分析結(jié)果表明， TaTFL1基因編碼蛋白屬于兼性蛋白。通過(guò)CBS-SignalP對(duì)TaTFL1蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，TaTFL1蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白。Cell-PLoc 2.0的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，TaTFL1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。通過(guò)CBS-Protfun2.2對(duì)編碼蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，TaTFL1蛋白在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫應(yīng)答及生長(zhǎng)因子方面的幾率均超過(guò)0.5，且行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的可能性最大， TaTFL1-5A、TaTFL1-5B和TaTFL1-5D蛋白的幾率分別為0.613、0.613和0.705；三者屬于酶的可能性均達(dá)到了0.46～0.47，幾率均大于1.6，表明TaTFL1蛋白可能屬于酶。

A：ATG 和 TGA分別代表起始密碼子和終止密碼子，黑色方框和直線分別代表外顯子和內(nèi)含子，數(shù)字表示外顯子和內(nèi)含子的長(zhǎng)度(bp)。A:ATG and TGA represent initiation codon and termination codon,respectively. Black box and lines represent exonic and intronic regions,respectively. Numbers indicate the length of exons and introns(bp).

黑色方框代表PEBP家族典型的氨基酸結(jié)構(gòu)和TFL1獨(dú)特的氨基酸殘基；黑色粗線條部分為T(mén)FL1同源蛋白底物結(jié)合保守域；Ta：小麥；Br：蕪菁；Fc：無(wú)花果；Vu：豇豆；Hv：大麥；Lp：黑麥草；Tu：烏拉爾圖小麥；Gm：大豆；Aet：山羊草；Bd：二穗短柄草；Os：水稻；Ob：短花藥野生稻；TFL1和ZCN3分別來(lái)自擬南芥和玉米。Black box region represents a typical amino acid structure of PEBP gene family and unique amino acid residues of TFL1; the thick black line represents substrate binding conservative domain of TFL1 homologous protein; Ta:Triticum aeativum L.; Br:Brassica rapa; Fc:Ficus carica; Vu:Vigna unguiculate; Hv:Hordeum vulgare subsp; Lp:Lolium prernne; Tu:Triticum urartu; Gm:Glycine max; Aet:Aegilops tauschii; Bd:Brachypodium distachyon; Os:Oryza sativa; Ob:Oryza brachuantha; TFL1 and ZCN3 are derived from Arabidopsis thaliana and Zea mays,respectively.

2.3 TaTFL1蛋白多重比對(duì)及進(jìn)化分析

用DNAMAN 5.0軟件將烏拉爾圖小麥(EMS48180.1)、黑麥草(AAG31808.1)、青稞(ABF85670.1)、玉米(ABX11005.1)、山羊草(XP_020199337.1)、二穗短柄草(XP_003578901.1)、水稻(XP_015617887.1 )、短花藥野生稻(XP_006662737.1)等植物的TFL1同源蛋白與TaTFL1-5A(ATI23645.1)、 TaTFL1-5B(ATI23646.1)、 TaTFL1-5D(ATI23647.1)蛋白進(jìn)行多重比對(duì)(圖3)。從圖3中可以看出，TaTFL1蛋白與其他物種的TFL1同源蛋白均具有PEBP家族典型的氨基酸結(jié)構(gòu)：如70～74殘基間的D-P-D-V-P模塊及116～119之間的G-I-H-R模塊，而且還具有TFL1亞家族獨(dú)特的His88和Asp144殘基，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)所獲得的 TaTFL1基因序列的正確性。TaTFL1蛋白與其他單子葉植物的TFL1同源蛋白進(jìn)行比對(duì)，其相似度為91.9%～100%，其中TaTFL1-5A和TaTFL1-5B蛋白與烏拉爾圖小麥的同源蛋白一致， TaTFL1-5D蛋白與山羊草的一致，該結(jié)果表明，TFL1蛋白在單子葉植物中具有高度的保守性。而與雙子葉植物比對(duì)的相似度也達(dá)到了69.27%～79.19%，可知TFL1蛋白在單子葉和雙子葉中存在較大的差異。

利用MEGA 6.0軟件，采用NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，對(duì)TFL1蛋白在各物種中的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果(圖4)表明，單子葉與雙子葉植物的TFL1同源蛋白分別聚為兩類(lèi)，本研究得到的TaTFL1蛋白與烏拉爾圖小麥和山羊草的親緣關(guān)系最近，而與大豆和豇豆的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

●代表本研究中 TaTFL1基因的編碼蛋白?！?indicates the deduced proteins of three TaTFL1 genes obtained in this study.

2.4 啟動(dòng)子的克隆及預(yù)測(cè)分析

以CS的gDNA為模板，以TP-F/TP-R為引物克隆得到 TaTFL1基因的上游序列，電泳結(jié)果如圖1B所示。測(cè)序結(jié)果表明，共獲得三類(lèi)序列，進(jìn)一步與Ensembl plants數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確認(rèn)其分別為 TaTFL1-5A、 TaTFL1-5B和 TaTFL1-5D的上游序列。對(duì)啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)起始密碼子上游1 200 bp的序列為啟動(dòng)子區(qū)。利用PlantCARE分析其中的順式作用元件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三個(gè)部分同源基因啟動(dòng)子的順式作用元件組成完全一致，均含有多種參與光響應(yīng)的元件，如AE-box、AT1-motif、Box 4、G-Box、G-box、Gap-box和sp1等元件，同時(shí)還含有與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件(CAT-box)、MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(MBS)、赤霉素響應(yīng)元件(P-box)、及與節(jié)律調(diào)控有關(guān)的順式調(diào)控元件(circadian)(圖5)。

圖5 TaTFL1-5A、 TaTFL1-5B和 TaTFL1-5D啟動(dòng)子序列比對(duì)及其預(yù)測(cè)的元件分析

2.5 TaTFL1基因在中國(guó)春不同組織及不同時(shí)期的表達(dá)分析

不同組織中 TaTFL1的表達(dá)分析表明， TaTFL1在不同組織不同時(shí)期均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異。相對(duì)于其他組織，穗下莖中的表達(dá)量最高，且隨著植株的逐漸發(fā)育，其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)(圖6A)。在葉片中， TaTFL1有較低水平的表達(dá)，在剛萌發(fā)的芽中就開(kāi)始表達(dá)，在幼苗期和花前時(shí)期葉片中的表達(dá)量明顯高于花后灌漿期的表達(dá)量(圖6B)。而在幼穗中，其表達(dá)量?jī)H次于穗下莖中的表達(dá)量，隨著幼穗的逐漸生長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸降低(圖6C)。穎殼中 TaTFL1的表達(dá)量無(wú)論在花期還是在花后都始終維持在很低的水平(圖6D)。籽粒中的表達(dá)量總體較低，且隨著籽粒的逐漸成熟而有明顯的下降趨勢(shì)(圖6D)，在幼根中也有低水平的表達(dá)(數(shù)據(jù)未列出)。由此可知， TaTFL1在小麥中的表達(dá)具有明顯的組織特異性，且主要在開(kāi)花前期的幼穗與穗下莖中表達(dá)。

3 討 論

本試驗(yàn)對(duì)TaTFL1蛋白的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的可能性最大，而前人的研究結(jié)果也表明了該基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。擬南芥和其他植物中的 TFL1基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)延長(zhǎng)，次級(jí)花序的增加，以及轉(zhuǎn)基因擬南芥的開(kāi)花延遲[15-19]。如在水稻中，過(guò)表達(dá)水稻的 TFL1同源基因?qū)е滤舅敕种υ黾?，開(kāi)花數(shù)是野生型的3倍，小穗排列更緊密，同時(shí)也引起了植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，說(shuō)明水稻中也存在著對(duì) TFL1功能的響應(yīng)途徑[4]；將黑麥草 LpTFL1轉(zhuǎn)入擬南芥中過(guò)表達(dá)，植株開(kāi)花明顯延遲，側(cè)分枝大量增加[9]；將玉米的 ZCN1到 ZCN6過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)同源性越高則表型表現(xiàn)得越強(qiáng)烈，能導(dǎo)致玉米晚花，花序的分枝大量增加[20]；然而，將大麥 HvTFL1轉(zhuǎn)入水稻中，其轉(zhuǎn)化植株并未在開(kāi)花時(shí)間和穗部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，推測(cè)是大麥與水稻可能有著不同的開(kāi)花途徑[21]。由此可知， TFL1及其同源基因的功能在許多植物中是保守的，因此我們推測(cè)小麥中 TaTFL1可能也在維持花序分生組織狀態(tài)和抑制開(kāi)花的功能上存在相似性。

圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different lower-case letters above bars indicate significant difference at 0.05 level.A1：花前；A2：花后5天；A3：花后10天；A4：花后15天；B1：芽；B2：萌發(fā)5天的葉；B3：萌發(fā)10天的葉；B4：花前的旗葉；B5：花后5天的旗葉；B6：花后10天的旗葉；B7：花后15天的旗葉；C1：1～2 cm幼穗；C2：2～4 cm幼穗；C3：4～5 cm幼穗；C4：5～6 cm幼穗。D1：花前的穎殼；D2：花后5天的穎殼；D3：花后10天的穎殼；D4：花后15天的穎殼；D5：花后5天的籽粒；D6：花后10天的籽粒；D7：花后15天的籽粒。A1:Pre-anthesis; A2:5 days after flowering;A3:10 days after flowering;A4:15 days after flowering； B1:Bud; B2:Leaf at 5 days after germination;B3:Leaf at 10 days after germination; B4:Flag leaf pre-anthesis; B5:Flag leaf at 5 days after flowering; B6:Flag leaf at 10 days after flowering;B7:Flag leaf at 15 days after flowering；C1:1-2 cm young spike; C2:2-4 cm young spike; C3:4-5 cm young spike;C4:5-6 cm young spike；D1:Glume pre-anthesis; D2:Glume at 5 days after flowering; D3:Glume at 10 days after flowering; D4:Glume at 15 days after flowering; D5:Grain at 5 days after flowering; D6:Grain at 10 days after flowering; D7:Grain at 15 days after flowering.

本研究克隆得到小麥第五同源群上的 TaTFL1部分同源基因，并測(cè)定 TaTFL1在不同組織不同時(shí)期的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥 TaTFL1-5A、 TaTFL1-5B和 TaTFL1-5D部分同源基因與擬南芥中 TFL1基因結(jié)構(gòu)相同，同樣由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成[22]。本研究獲得的3個(gè) TaTFL1部分同源基因的CDS序列只存在較少的堿基差異，其預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)為 TaTFL1-5A與TaTFL1-5B蛋白完全一致，而TaTFL1-5D與前者只在第64位氨基酸殘基存在差異。本研究獲得的3條 TaTFL1基因所編碼蛋白的第88位氨基酸殘基皆為His，且還具有TFL1家族典型的氨基酸結(jié)構(gòu)，有研究表明TFL1蛋白的His88對(duì)其結(jié)構(gòu)與活性具有至關(guān)重要的作用[19,23]。

TFL1基因雖然與FT基因的同源性較高，但兩者的表達(dá)模式具有明顯的差異。FT基因在葉片中的轉(zhuǎn)錄水平最高，其翻譯的蛋白質(zhì)作為成花素，從葉片中由韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到莖頂端分生組織處，活化花分生組織特性基因的表達(dá)，從而促進(jìn)開(kāi)花；而 TFL1基因在頂端分生組織中的表達(dá)量最高[24]。在本試驗(yàn)中，小麥 TaTFL1在葉片中的表達(dá)量極低，結(jié)果與黑麥草[9]等相同，而與甘蔗[25]在頂端周?chē)~片中大量表達(dá)不同。Ratcliffe等[26]的研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá) TFL1基因的擬南芥植株能產(chǎn)生更好的種子，也有人認(rèn)為擬南芥中 TFL1能引起胚乳細(xì)胞化從而控制籽粒的大小。而在本試驗(yàn)中， TaTFL1在籽粒中的表達(dá)量較低，且隨著籽粒的逐漸成熟而呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，說(shuō)明小麥 TaTFL1與擬南芥中 TFL1在籽粒發(fā)育中發(fā)揮的作用可能存在差異。為了明晰 TaTFL1是否參與了小麥幼穗的發(fā)育，本研究分析了 TaTFL1基因在不同大小幼穗中的表達(dá)情況，分析結(jié)果表明該基因在幼穗中的表達(dá)量較高，且隨著幼穗的逐漸長(zhǎng)大而表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，推測(cè)小麥 TaTFL1基因主要在小麥幼穗發(fā)育初期起作用，該結(jié)果與擬南芥[27]、黑麥草[9]等植物中的研究結(jié)果相同，而且 TaTFL1啟動(dòng)子元件分析結(jié)果也表明其啟動(dòng)子中存在著分生組織表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件(CAT-box)。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn) TaTFL1在穗下莖中大量表達(dá)，這與玉米中 ZCN1、ZCN2和 ZCN3在維管束中大量存在可能類(lèi)似，具體原因還有待進(jìn)一步的研究[20]。