小麥抗逆相關基因 TaGB1的克隆及其表達特性分析

王小婷，王文靜，李 波，楊雯晶，胡衛(wèi)國

(1.河南省農業(yè)科學院小麥研究所/河南省小麥生物學重點實驗室/農業(yè)部黃淮中部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/國家小麥工程實驗室，河南鄭州 450002；2.西北農林科技大學農學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；3.陜西省農業(yè)機械鑒定推廣總站，陜西西安 710003)

異源三聚體GTP結合蛋白(G蛋白)是由α、β、γ亞基(Gα、Gβ、Gγ)組成的膜蛋白復合物，參與介導真核生物中保守的信號傳導網(wǎng)絡[1]。在傳統(tǒng)模式中，異源三聚體GTP結合蛋白通過細胞膜限定結合外界的多種信號，然后通過G蛋白偶聯(lián)的受體蛋白(GPCR)將外界信號傳遞至下游的效應蛋白，最終引起轉錄水平的調控，進而響應外界環(huán)境的刺激。

通常認為植物G蛋白信號傳導機制與動物G蛋白相似，但是植物中GPCR信號元件的種類和數(shù)量與動物中不同[2]。在哺乳動物中，由20個Gα、5個Gβ和12個Gγ亞基組成的異源組合為超過800個基因編碼的巨大的GCPRs家族提供了信號特異性[3]。哺乳動物G蛋白偶聯(lián)的信號通路參與體內大量的生理過程，并且跟許多疾病狀態(tài)相關，這使得G蛋白成為藥物治療的重要靶標[4]。除參與疾病治療之外，G蛋白在發(fā)育階段的信號傳遞過程中也履行重要的功能[3]，如有絲分裂過程中的保守功能[5]。然而與哺乳動物及其他真核生物相反，植物中僅有幾種常見的G蛋白亞基種類，如模式植物擬南芥基因組僅含有1個Gα、1個Gβ和2個Gγ亞基[6]。除此之外，擬南芥基因組不具備編碼動物中已知效應蛋白同系物的能力[7]。在水稻基因組中，含有1個Gα( RGA1)[8]、1個Gβ(RGB1)[9]和目前已報道的Gγ1(RGG1)[10]。與哺乳動物相比，植物的G蛋白相關組件較少[7]，但諸多研究表明，植物G蛋白同樣參與眾多的生理過程，包括細胞分裂[11-12]、離子通道調節(jié)[13-14]、種子萌發(fā)[15]、生物和非生物脅迫響應[16-17]、藍光介導的響應[18]等。

小麥是世界兩大谷類作物之一，同時也是能最大限度適應惡劣環(huán)境條件的主要糧食作物[19]。目前，關于異源三聚體G蛋白在普通小麥中的研究報道多是關于抗銹病、白粉病或蚜蟲等[20]，且研究多是關于異三聚體G蛋白中的小G蛋白[21-24]。從普通小麥品種S615中，研究人員克隆得到編碼G蛋白α亞基的兩個基因TaGA1和TaGA2[25]。編碼G蛋白β亞基基因的全長cDNA序列也從S615中被克隆得到，被命名為 TaGB1，其編碼380個氨基酸，并且與其他植物和動物的G蛋白β亞基結構相似， TaGB1同樣也具有7個WD40保守域[26]。但以上研究并未就 TaGB1的基因特性及表達情況進行分析，其與雙子葉植物同源基因的進化關系等方面研究也存在空白。

本研究選取典型的雙子葉模式植物擬南芥為比較對象，分析小麥G蛋白β亞基基因 TaGB1與其他植物中的G蛋白β亞基之間的親疏關系，通過系統(tǒng)發(fā)育進化樹研究 TaGB1進化上的親緣關系，并分析 TaGB1在不同脅迫處理條件下的表達情況、蛋白定位以及組織特異性等，以期為解析小麥中G蛋白β亞基的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥品種濟麥22種子由本實驗室保存，大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10購于江蘇康為生物科技有限公司，亞細胞定位表達載體16318h-GFP由本實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1 小麥材料處理

取適量小麥種子于培養(yǎng)皿內，7‰過氧化氫浸泡12 h破除休眠，清水沖洗3遍，室溫萌發(fā)后移至96孔透明板進行水培，在溫度22 ℃、相對濕度65%、光照周期16 h/8 h下生長10 d左右。整株及根、莖、葉分別取樣后，液氮速凍，-80 ℃保存。

取水培10 d左右的生長狀態(tài)一致的小麥幼苗進行干旱、ABA、鹽及熱脅迫處理。干旱脅迫處理：用吸水紙擦干幼苗表面水分，置于干燥濾紙上對幼苗進行自然脫水處理，分別于0 h、2 h、3 h、12 h、24 h取樣。 ABA脅迫處理：小麥幼苗置于含有100 μmol·L-1ABA的水培液中進行脅迫處理，分別于0 h、2.5 h、7 h、25 h、48 h、72 h不同時間點整株取樣。100 mmol·L-1NaCl脅迫處理：取幼菌于含有100 mmol·L-1NaCl的水培液中培養(yǎng)，分別在0 h、1 h、4 h、12 h、24 h、48 h整株取樣；熱脅迫處理：除幼苗置于37 ℃溫度下培養(yǎng)，分別在0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h整株取樣，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2.2 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成

植物樣品總RNA提取按照全式金TransZol Up說明書操作步驟，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，反轉錄cDNA第一鏈的合成參照全式金反轉錄試劑盒操作(貨號：AT-311)。

1.2.3 小麥 TaGB1基因克隆

根據(jù)小麥G蛋白β亞基 TaGB1(ACCESSION：AB090160)序列，設計正向引物(5′-ATGGCGTCCGTGGCGGAGCTCAA-3′)和反向引物(5′-TCAGACTATCTTGCGGTGTCCAC-3′)，以反轉錄得到的cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR進行PCR擴增。反應體系：2×PrimeSTAR GC Buffer 25 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)4 μL， 正向引物(10 μmol·L-1)1 μL，反向引物(10 μmol·L-1)1 μL，cDNATemplate 2 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U·μL-1)0.4 μL，ddH2O 16.6 μL。PCR程序設定為95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s，69 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35 cycles；72 ℃ 10 min；16 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物大小，將目的片段利用TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit進行膠回收，構建至零背景克隆載體pZero Back/Blunt Vector，連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)TOP10，挑取陽性單克隆菌液送北京奧科鼎盛生物技術有限公司測序。

1.2.4 生物信息學分析

利用分子生物學軟件Clustal X 2.0和DNAMAN進行多重序列比對；運用在線網(wǎng)站ProtParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)預測蛋白分子量和等電點；利用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹；采用在線工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白質保守域預測。

1.2.5 TaGB1亞細胞定位

對亞細胞定位載體16318h-GFP進行BamHI單酶切，酶切產(chǎn)物回收，按照In-Fusion快速克隆試劑盒說明書將 TaGB1目的片段與酶切產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)TOP10，選取陽性菌液送測序。

選取生長1周的濟麥22小麥幼苗葉片制備原生質體，采用PEG介導的轉化方法將已測序正確的重組質粒16318h-GFP:: TaGB1和空載體同時轉化至小麥原生質體細胞，避光培養(yǎng)16 h后觀察蛋白的表達。

1.2.6 TaGB1基因的表達模式分析

分別以小麥幼葉、根、莖，以及不同脅迫處理條件下的小麥植株樣品為材料，進行總RNA提取及cDNA第一鏈的合成，具體方法參照1.2.2中所述步驟。實時熒光定量PCR具體操作步驟依據(jù)天根Real Master Mix(SYBR Green)說明書，以反轉錄的cDNA為模板，內參基因FP(5′-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3′)和RP(5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′)，依據(jù) TaGB1序列設計引物分別為F1(5′-ACCCGCTTGATT ACAGGCTC-3′)、R1(5′-TGATATGTCCGAA CTGCCCG-3′)和F2(5′-CCCTGATGGTCAG AGGTTCG-3′)R2(5′-AGCGTGTCCCACACAT AACA-3′)。反應體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，正向引物(10 μmol·L-1)0.3 μL，反向引物(10 μmol·L-1)0.3 μL，cDNA模板 2 μL，RNase-free Water 7 μL。

采用熒光定量PCR儀(ABI 7500)3步法反應程序進行PCR擴增：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40 cycles，在72 ℃ 30 s時進行熒光信號采集。根據(jù)各樣品特定熒光閾值下的Ct值，依據(jù)計算公式2-△△Ct比較基因的相對表達量。每個樣本設置至少3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 小麥 TaGB1的基因序列特性分析

對濟麥22的 TaGB1進行克隆(圖1)、測序和BLAST分析表明，該基因分別位于小麥基因組4A、4B和4D染色體上，分別命名為 TaGB1A、TaGB1B和 TaGB1D。 TaGB1基因編碼區(qū)全長1 143 bp，包含6個外顯子和5個內含子，編碼380個氨基酸，預測分子量為41 kD。 TaGB1在A、B和D染色體組間十分保守，對 TaGB1A、 TaGB1B和 TaGB1D多肽序列進行比對發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列同源性高達99.91%，僅在第330位氨基酸存在差異(圖2)，A染色體組中對應的氨基酸是纈氨酸(Val)，而B和D染色體組中均是甲硫氨酸(Met)。由此推測 TaGB1在A、B和D染色體組中具有相似的功能。

M：DL2000；1～3： TaGB1 PCR 產(chǎn)物。M：DL2000; 1-3： TaGB1 PCR product.

紅色標注為甲硫氨酸，綠色標注為纈氨酸。The red mark represents methionine，the green mark represents valine.

對 TaGB1的氨基酸序列進行結構域預測，發(fā)現(xiàn)其含有7個WD40保守域(圖3)。為進一步分析 TaGB1與雙子葉模式植物擬南芥的G蛋白β亞基 AGB1氨基酸序列差異，將 TaGB1各拷貝的多肽序列與 AGB1的多肽序列進行多重比對，結果(圖4)顯示， TaGB1與 AGB1同源性高達93.46%，且 TaGB1與 AGB1的第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ個WD40保守域相同，第Ⅱ個和第Ⅴ個WD40保守域存在差異。據(jù)此推斷，小麥基因 TaGB1與 AGB1在功能上可能有部分相似性。

2.2 TaGB1系統(tǒng)發(fā)育進化分析

系統(tǒng)發(fā)育進化分析(圖5)表明，不同植物的G蛋白β亞基蛋白序列高度相似， TaGB1在親緣關系上與節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)、大麥(HordeumvulgareL.)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、燕麥(AvenafatuaL.)等禾本科植物較近；從大的進化關系來看，G蛋白β亞基在物種進化上趨向于劃分為單、雙子葉兩條途徑，小麥G蛋白β亞基 TaGB1進化上屬于單子葉植物大類，與擬南芥等雙子葉植物的親緣關系較遠。

圖3 TaGB1蛋白序列保守域(conserved domains)分析

圖中紅色橫線標注為Ⅰ-Ⅶ7個WD40保守域，紅色矩形標注為 TaGB1不同拷貝間氨基酸序列差異。Seven WD40 conserved domains in AGB1 are underlined in red,and sequence differences are indicated with red rectangle.

圖5 系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

2.3 TaGB1表達模式分析

檢測結果(圖6)表明，在ABA和NaCl脅迫下， TaGB1的表達趨勢相似，在一定時間范圍內，其相對表達量趨于上升，分別在處理后7 h和24 h左右達到最大值，之后趨于下降；在干旱脅迫下，在處理后0～12 h之間， TaGB1的表達基本上維持較穩(wěn)定的水平，處理24 h左右后表達量迅速上升，約是處理前的3倍；熱脅迫下， TaGB1的相對表達量在處理6 h左右時達到最大值，約是處理前的20倍。這說明 TaGB1基因表達受外界脅迫如ABA、NaCl、熱和干旱誘導，推測該基因參與植物抗逆信號傳導途徑。

2.4 TaGB1亞細胞定位及組織特異性分析

以正常生長1周的小麥幼苗葉片為材料制備小麥原生質體，將重組質粒16318h-GFP:: TaGB1和空載體16318h-GFP同時轉化原生質體細胞。觀察結果(圖7A)表明，陽性對照16318h-GFP在細胞膜、細胞質和核均能觀察到熒光信號，證明PEG介導轉化過程正常， TaGB1蛋白定位于胞質內成斑點狀，且斑點狀信號很強，除此之外，質膜上也存在微弱的熒光信號。組織特異性表達水平(圖7B)顯示，在正常生長條件下， TaGB1在幼苗的葉、根及莖中都有轉錄活性，但不同部位中相對表達水平存在差別，葉片中較高，而在根和莖中較低，說明該基因在感知外界信號和信號傳遞方面發(fā)揮作用。

圖6 TaGB1表達模式

圖7 TaGB1蛋白亞細胞定位及組織特異性分析

3 討 論

研究表明，G蛋白β亞基C端含有一組7個重復串聯(lián)的WD40結構[9]，7個重復串聯(lián)的WD40結構含有與Gα亞基以及下游效應因子相互作用位點，影響蛋白與蛋白之間的相互作用[35]。前人研究發(fā)現(xiàn)，編碼小麥G蛋白β亞基的 TaGB1包含7個WD40保守域，與其他植物和動物的G蛋白β亞基類似[26]，本研究結果與此一致。擬南芥有很多蛋白都包含WD40重復結構(WD40保守域)，G蛋白β亞基 AGB1就是其中之一。本研究將 TaGB1的氨基酸序列與 AGB1的氨基酸序列進行多重比對，結果表明，除第Ⅱ個和第Ⅴ個WD40結構存在差異外，其余5個WD40保守域完全相同，說明G蛋白β亞基在不同物種的進化中具有高度保守性，WD40蛋白在多種細胞發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵作用，因此，推測小麥抗逆基因 TaGB1可能與 AGB1具有部分相似功能。

TaGB1在親緣關系上與禾本科等單子葉植物較近，而與擬南芥、煙草等雙子葉植物較遠，即分化形成兩大分支(圖5)，這在植物G蛋白β亞基的相關研究中鮮有報道。根據(jù)上述 TaGB1和 AGB1的WD40保守域差異結果，推測這種進化上的分化與WD40保守域的差異存在一定的聯(lián)系，但具體的機制仍需進一步探究。

AGB1的表達幾乎貫穿植物生長的全部階段，并且存在于各種組織器官中，包括根、花、莖、蓮座葉、種子等[27-28]。本試驗對 TaGB1進行表達分析表明， TaGB1在小麥根、莖、葉均有不同程度的表達，這與已有報道一致，但 TaGB1在葉中的表達量較高，原因可能是植物主要利用葉片感知外界刺激并傳導至細胞內部引起一系列級聯(lián)反應，或者可能是在植物不同的生長發(fā)育階段中，不同組織部位依據(jù)各自發(fā)揮功能的主、次而引起表達量的變化，如水稻中 RGA1和 RGB1的mRNA在根部的積累低于在d線區(qū)域的積累，但是擬南芥中正好相反，即 GPA1和 AGB1的mRNA在根部的積累較高[29]。

研究表明，高溫、氧化脅迫、高鹽處理下，豌豆G蛋白成員PsGα和PsGβ在轉錄水平大量表達[31]；水稻G蛋白各亞基受非生物脅迫和激素ABA誘導表達[32]。Colaneri等[33]和Ma[30]研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白調節(jié)鹽處理下植物的生長發(fā)育，并且擬南芥G蛋白β亞基突變體agb1-2對缺水的適應性增強[34]。 AGB1通過調節(jié)滲透脅迫、離子穩(wěn)態(tài)和氧脅迫來正向調控植物的耐鹽性[30]。本研究中， TaGB1在鹽脅迫下上調表達，脅迫處理約24 h后表達量最高，隨著時間的延長，表達呈現(xiàn)下降趨勢， TaGB1在熱脅迫下表達上調，處理后6 h左右表達量最高，這與已有的一些研究結果相符。環(huán)境脅迫會刺激植物產(chǎn)生內源ABA，這些ABA的產(chǎn)生調節(jié)植物的生長發(fā)育[35]。本研究中 TaGB1受外源激素ABA及干旱脅迫條件誘導上調表達，在處理后24 h達到最大值，說明 TaGB1 可能通過依賴ABA的信號通路調控植物的耐旱性。

有文獻報道，其他植物中G蛋白β亞基的定位多是在質膜和核[41]，以及細胞內其他的組分上[37-39]。本研究中，小麥 TaGB1蛋白主要定位于胞質，呈斑點狀，質膜上亦存在微弱的GFP信號。關于小麥G蛋白β亞基胞質內斑點狀定位，推測可能是高爾基體，準確定位有待進一步研究。

WD40重復保守域在植物體內扮演重要角色，包括介導不同蛋白質間的相互作用[2,40]，以及參與蛋白質的降解過程等[41-42]。本研究中對 TaGB1的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析以及 TaGB1和AGB1的WD40保守域差異分析，推測不同物種間G蛋白β亞基表達部位的差異可能與其進化分類相關，小麥G蛋白β亞基胞質內斑點狀定位也可能與WD40功能域存在某種關聯(lián)，因此關于 TaGB1斑點狀定位具體的原因以及與WD40功能域之間的關系，仍需更進一步的研究。