D-阿洛酮糖的功能及其生物合成研究進展

沈雪梅，王靖，張媛，王小艷，丁子元，李義，陳博，佟毅

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D-阿洛酮糖的功能及其生物合成研究進展

沈雪梅1,2,3*，王靖1,2,3*，張媛1,2,3，王小艷1,2,3，丁子元1,2,3，李義4，陳博1,2,3，佟毅4

1 中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209 2 營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209 3 老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，北京 102209 4吉林中糧生化有限公司 (玉米深加工國家工程研究中心)，吉林 長春 130033

沈雪梅, 王靖, 張媛, 等. D-阿洛酮糖的功能及其生物合成研究進展. 生物工程學(xué)報, 2018, 34(9): 1419–1431.Shen XM, Wang J, Zhang Y, et al. Research progress of D-psicose: Function and its biosynthesis. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1419–1431.

隨著肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病率在全球范圍急劇上升，人們對食品營養(yǎng)和健康等問題日益關(guān)注。D-阿洛酮糖作為重要的天然稀有己酮糖，不僅保持良好的甜度，而且具有降血糖、降血脂、抗氧化等功效，逐漸成為食品、保健和醫(yī)療領(lǐng)域的研究熱點。文中闡述了D-阿洛酮糖的主要生理功能，綜述了D-阿洛酮糖的生物合成研究進展及其酮糖3-差向異構(gòu)酶的晶體結(jié)構(gòu)，為篩選D-阿洛酮糖的產(chǎn)生菌株及提高合成酶的熱穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化率提供理論指導(dǎo)，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

D-阿洛酮糖，功能，合成，差向異構(gòu)酶，活性，穩(wěn)定性

隨著城市化進程加快、環(huán)境污染日益嚴重、人們生活方式的改變及人口老齡化，肥胖、糖尿病等慢性代謝性疾病的發(fā)病率在全球范圍急劇上升。2016年上發(fā)布的相關(guān)研究成果稱，我國已經(jīng)超越美國成為全球肥胖人口最多的國家[1]。肥胖癥既是一個獨立的疾病，又是2型糖尿病、心血管病、腦卒中和多種癌癥等慢性病的危險因素，被世界衛(wèi)生組織列為導(dǎo)致疾病負擔(dān)的十大危險因素之一。同時，國際糖尿病聯(lián)合會 (IDF) 發(fā)布，世界范圍內(nèi)糖尿病成年患者大約有4.15億名，而我國的糖尿病患者最多，約1.1億 (占中國成年人的11.6%)，糖尿病前期人群為4.934億 (50.1%)。2017年發(fā)布數(shù)據(jù)顯示[2]，2015年由于糖尿病造成全球經(jīng)濟損失達1.31萬億美元，占全球GDP的1.8%；其中，間接經(jīng)濟損失占所有損失的34.7%。2015年，中國糖尿病相關(guān)的醫(yī)療花費總計510億美元，居全世界第二位，僅次于美國。糖尿病、超重/肥胖等代謝性疾病已經(jīng)成為全球性危機，而過多食用糖類、造成能量過剩成為引起肥胖和糖尿病的一個重要原因。因此，新型低熱量甜味劑逐漸成為食品、保健和醫(yī)療領(lǐng)域的研究熱點之一。

D-阿洛酮糖 (D-psicose) 是近年發(fā)現(xiàn)的一種具有特殊保健功能的新型功能性單糖，其甜度相當于蔗糖的70%，熱量相當于蔗糖的0.3%[3]，具有與蔗糖相近的口感及容積特性，同樣可與食物中的氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)[4]，可作為食品中蔗糖理想的替代品[5]。2011年8月，美國食品與藥物管理局 (FDA) 確定D-阿洛酮糖為普遍公認安全食品 (Generally regarded as safe，GRAS)，并可作為食品或食品添加劑的組成成分[6]。D-阿洛酮糖作為D-果糖的差向異構(gòu)體，可通過微生物來源的酮糖3-差向異構(gòu)酶催化D-果糖C-3差向異構(gòu)化獲得。因此，酮糖3-差向異構(gòu)酶是D-阿洛酮糖生物合成過程中的關(guān)鍵因素。

隨著越來越多微生物基因組數(shù)據(jù)的公布，為基于酮糖3-差向異構(gòu)酶基因高效篩選D-阿洛酮糖產(chǎn)生菌提供了可能，因此越來越多不同種屬來源的D-阿洛酮糖產(chǎn)生菌被報道。然而，多數(shù)酮糖3-差向異構(gòu)酶在最適反應(yīng)條件下半衰期較短，同時目前已報道的最高轉(zhuǎn)化率僅為33%。本文系統(tǒng)總結(jié)了D-阿洛酮糖的主要生理功能，旨在闡釋其廣泛的應(yīng)用前景，同時重點綜述了D-阿洛酮糖的生物合成及其合成酶的晶體結(jié)構(gòu)，為提高酮糖3-差向異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化率提供指導(dǎo)，從而滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

1 D-阿洛酮糖的主要生理功能

Tsukamoto等[7]發(fā)現(xiàn)，采用大鼠靜脈注射14C標記的D-阿洛酮糖在肝臟、腎臟和膀胱中可檢測到較高水平，然后很快通過尿液排出體外，而大腦中沒有檢測到D-阿洛酮糖的積累?？诜腄-阿洛酮糖由小腸吸收進入血液，然后約70%通過尿液排出[7]，大鼠[8]或人體[9]中小部分未被吸收的D-阿洛酮糖會被傳輸?shù)酱竽c，最終在盲腸中部分發(fā)酵。研究顯示，相對于高果糖漿具有引發(fā)肥胖和糖尿病的風(fēng)險，D-阿洛酮糖具有控制肥胖和糖尿病的功效[10-11]。

1.1 D-阿洛酮糖對脂代謝的影響

Hossain等[12-13]在自發(fā)的2型糖尿病OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) 大鼠的飲水中添加5%的阿洛酮糖，喂養(yǎng)13周后發(fā)現(xiàn)大鼠腹部脂肪和身體脂肪重量明顯比對照組降低，且脂肪細胞小于對照組。在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠的正常飲食中添加不同劑量的D-阿洛酮糖，發(fā)現(xiàn)體重和體內(nèi)脂肪積累的量與對照組相比均有降低，并且降低程度對阿洛酮糖呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系[14]。給大鼠喂食3%阿洛酮糖4周，發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖組大鼠有明顯較低的血清胰島素和瘦素水平，肝臟中脂肪合成酶的活性降低，而脂肪氧化酶表達水平上升，推測D-阿洛酮糖能夠降低脂肪積累是通過抑制脂肪合成和提高脂肪分解速度實現(xiàn)的[15]。糖尿病模型小鼠經(jīng)12周5% D-阿洛酮糖喂食實驗，與蔗糖組相比，小鼠體重、脂肪增量均顯著降低，基因分析顯示與脂肪合成相關(guān)的PPAR-7、C/EBPα基因表達量下降，與炎癥反應(yīng)相關(guān)的TNF-α及IL-6基因表達量也出現(xiàn)下降[16]。Han等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，5%的飲食D-阿洛酮糖能通過降低小腸中脂調(diào)控相關(guān)基因表達，下調(diào)肝臟中脂肪酸合酶和β-氧化的活性，降低血漿及肝臟脂質(zhì)含量提高糞脂，最終使食源性肥胖的代謝狀態(tài)正常化。Kimura等[18]在健康人群中進行的實驗發(fā)現(xiàn)，餐前攝入少量D-阿洛酮糖 (5 g) 可起到增強餐后脂肪氧化和降低碳水化合物氧化的效果。因此，阿洛酮糖被認為具有抵抗肥胖的潛力。

1.2 D-阿洛酮糖對血糖代謝的影響

多項研究表明，D-阿洛酮糖具有降血糖的功效[19-20]。雄性大鼠喂食蔗糖、麥芽糖或可溶性淀粉，同時按千分之一添加D-阿洛酮糖或D-果糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿洛酮糖能抑制血漿中的葡萄糖濃度；在大鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，阿洛酮糖口服后會經(jīng)過小腸吸收進入血液，然后由腎臟排出，不會引起血糖波動，還能夠抑制α-葡萄糖苷酶的活性[20]。以健康人群為受試對象，食用5 g阿洛酮糖可顯著抑制攝入75 g麥芽糊精后導(dǎo)致的血糖上升，同時單獨攝入5 g阿洛酮糖對血糖和胰島素水平?jīng)]有影響，說明阿洛酮糖不會誘發(fā)低血糖[19]。從預(yù)防糖尿病的角度出發(fā)，以邊緣性糖尿病病人為對象，同樣發(fā)現(xiàn)阿洛酮糖對餐后血糖有明顯的抑制效果，并且沒有副作用[21]。Hossain等[22]開展的人群試驗同樣證明，阿洛酮糖能降低正常人和邊緣糖尿病人的餐后血糖水平，并且具有劑量依賴性。

1.3 D-阿洛酮糖抗糖尿病的機理

Hossain等[10]開展的OLETF大鼠實驗顯示，阿洛酮糖組餐后血糖、體重和脂肪得到有效控制，免疫組化結(jié)果表明，阿洛酮糖可誘導(dǎo)肝葡糖激酶表達，從而提高肝糖原合成。進一步研究發(fā)現(xiàn)，阿洛酮糖可減緩β胰島細胞的纖維化[13]。將實驗時間延長至60周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖的抗2型糖尿病效果主要是通過維持血糖水平、降低體重增長、控制餐后血糖、減少炎癥反應(yīng)、降低糖化血紅蛋白水平實現(xiàn)的[10]。Shintani等[11]用Wistar大鼠進行連續(xù)10周喂食實驗，結(jié)果顯示，在30– 90 min間阿洛酮糖組胰島素水平明顯較低；在90–180 min之間阿洛酮糖組的血糖水平顯著降低，阿洛酮糖組的肝糖原水平3倍于對照組，并且肝葡糖激酶核輸出顯著增加，說明阿洛酮糖可以通過增強葡糖激酶的核輸出維持機體正常葡萄糖耐量和胰島素敏感性。另外，D-阿洛酮糖通過清除活性氧自由基而表現(xiàn)較高的抗氧化作用[23]，從而降低胰島β細胞的氧化損傷。近期，日本Iwasaki等[24]的研究團隊在健康小鼠和肥胖糖尿病模型小鼠中的實驗發(fā)現(xiàn)，服用D-阿洛酮糖能夠促進GLP-1的釋放并通過GLP-1受體信號影響迷走傳入神經(jīng)，起到抑制食量和高血糖癥的效果，并且效果與攝入的時間有關(guān)。

研究顯示，D-阿洛酮糖可以通過多種途徑預(yù)防肥胖和2型糖尿病 (圖1)[22]。由肥胖導(dǎo)致的2型糖尿病機體內(nèi)，脂肪組織增大伴隨著炎癥巨噬細胞的浸潤，隨之釋放巨噬細胞和脂肪細胞中的炎性細胞因子。此外，在高血糖狀態(tài)下，胰腺β細胞被迫產(chǎn)生更多的胰島素來抑制血糖升高，從而導(dǎo)致胰島肥大進而發(fā)展成β細胞損傷以及隨后的葡萄糖不耐受和2型糖尿病，同時，肝臟的葡萄糖輸出量增加，而脂肪組織和骨骼肌的葡萄糖利用率降低。而D-阿洛酮糖可以抑制脂肪合成和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達，保護胰島細胞免受高血糖引起的損傷，促使胰島素正常分泌，維持血液中正常的胰島素水平，降低腸道對葡萄糖的吸收，并且增加脂肪和肌肉組織對葡萄糖的攝取，從而實現(xiàn)控制體重和預(yù)防糖尿病的作用。

圖1 D-阿洛酮糖抗糖尿病和抗肥胖作用示意圖[22]

2 D-阿洛酮糖的生物合成研究進展

化學(xué)法制備D-阿洛酮糖由于產(chǎn)物純化步驟繁復(fù)、化學(xué)污染嚴重和副產(chǎn)物雜多等原因，尚未取得突破性進展。1990年，日本香川大學(xué) (Kagawa University) Izumori團隊發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)堿桿菌屬細菌sp．可以生產(chǎn)D-阿洛酮糖，開辟了生物法制備D-阿洛酮糖的先河[25]。生物轉(zhuǎn)化方法因反應(yīng)單一、純化步驟簡單等優(yōu)點，逐漸成為生產(chǎn)D-阿洛酮糖的主要策略。其中，酮糖3-差向異構(gòu)酶作為D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化的重要催化劑，可催化D-果糖與D-阿洛酮糖 (圖2) 及D-塔格糖與D-山梨糖之間的相互轉(zhuǎn)化。不同微生物來源的異構(gòu)酶具有不同的底物特異性，主要分為：D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶 (D-tagatose 3-epimerase，DTEase) 和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶 (D-psicose 3-epimerase，DPEase)。表1總結(jié)了不同菌株來源酮糖3-差向異構(gòu)酶的反應(yīng)情況。

圖2 酶催化D-果糖與D-阿洛酮糖間的轉(zhuǎn)化

2.1 D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶

Izumori團隊首次報道了菊芋假單胞菌來源的DTEase，并將其生物合成基因克隆到大腸桿菌JMl09中表達[26]。通過工藝優(yōu)化 (以chitopearl beads為載體)，結(jié)合離子交換，可使酶的結(jié)合效率達到90%，裝柱后在pH 7.0，溫度45 ℃條件下，以60%的D-果糖為底物，轉(zhuǎn)化率可達25%[27]。類球紅菌SK011來源的DTEase以D-果糖為底物，最終比活性為13.4 U/mg，其最適反應(yīng)條件為pH 9.0，溫度40 ℃，不需要金屬離子，相反，添加Zn2+或Cu2+會顯著降低其活性[28]。Zhang等[29]將閃爍梭菌ATCC 35704來源的DTEase基因克隆轉(zhuǎn)入.BL2 (DE3) 中，得到的重組酶在pH 7.5和60 ℃條件下，D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率為28%。Yoshihara等[30]發(fā)現(xiàn)球形節(jié)桿菌M30，作為GRAS菌株，能夠表達催化D-果糖和D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化的C-3差向異構(gòu)酶，其耐熱性較高，最適溫度為70 ℃。

2.2 D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶

2006年，韓國世宗大學(xué)Oh團隊從根癌農(nóng)桿菌中得到的DTEase對D-阿洛酮糖具有較強的特異性，因此被命名為DPEase。利用大腸桿菌表達該基因，以700 g/L D-果糖為底物，在50 ℃、pH 8.0、添加Mn2+的條件下反應(yīng)100 min后，D-阿洛酮糖濃度達到230 g/L，轉(zhuǎn)化效率為32.9%[31]。2011年該團隊利用易錯PCR技術(shù)構(gòu)建了DPEase的雙突變株 (I33L-S213C)，其在50 ℃條件下的半衰期提高了29.9倍[32]。2016年，Park等[33]利用該突變株的重組大腸桿菌，采用60 ℃和pH 8.5的反應(yīng)條件，利用4 g/L細胞濃度，在40 min后可將700 g/L D-果糖轉(zhuǎn)化為230 g/L的D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率為33% (/)，生產(chǎn)速率為345 g/(L·h)，比生產(chǎn)率為 86.2 g/(g·h)，這是目前為止報道的最高轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)率。

Mu等[34]從解纖維梭菌H10 (ATCC 35319) 中克隆得到的木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域TIM barrel蛋白編碼基因可在大腸桿菌體內(nèi)表達。經(jīng)鎳親合層析純化和酶活檢測證明該酶具有DPEase活性，且其最適溫度為55 ℃，最適pH為8.0，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率最高可達32%。此外，該酶在60 ℃高溫條件下，加入Co2+后半衰期可達6.8 h。Li等[35]將解纖維梭菌H10來源的DPEase基因克隆至枯草芽胞桿菌WB600，結(jié)果顯示該重組蛋白具有可溶性、高活性并可高效表達，其最適溫度為50 ℃，酶活反應(yīng)同樣不依賴金屬離子 (轉(zhuǎn)化率為27.61%±0.53%)。無金屬離子的情況下，35 ℃時該酶非常穩(wěn)定，但在50 ℃處理30 min，其活性降低50%；額外添加1 mmol/L Co2+，50 ℃條件下半衰期延長至265 min。因此，說明Co2+對于催化反應(yīng)是非必需的，但可提高DPEase的熱穩(wěn)定性。

瘤胃球菌sp.來源的DPEase基因結(jié)合芽孢桿菌來源的D-葡萄糖異構(gòu)酶 (BGI) 基因，在大腸桿菌BL21內(nèi)成功構(gòu)建了共表達體系，完成了從D-葡萄糖轉(zhuǎn)化形成D-阿洛酮糖的一步法雙酶偶聯(lián)反應(yīng)。結(jié)果表明，BGI和DPE共表達體系在65 ℃、pH 7.0以及Mg2+存在的條件下，以高果糖漿 (High-fructose corn syrup，HFCS) 為底物，反應(yīng)達到平衡時，HFCS中的葡萄糖、果糖和D-阿洛酮糖的摩爾比為3.0∶2.7∶1.0，D-阿洛酮糖的產(chǎn)量為135 g/L，占總糖漿的15%[36]。隨后，該研究團隊以谷氨酸棒狀桿菌為底盤，設(shè)計并構(gòu)建重組途徑，利用甘油和葡萄糖為底物，合成山梨糖、阿洛酮糖以及蒜糖醇等稀少糖[37-38]。Li等[39]將瘤胃菌來源的DPEase基因轉(zhuǎn)入食品級宿主短小芽胞桿菌，并實現(xiàn)該酶的高效表達，其比活性為58.6 U/mL，高于大腸桿菌體內(nèi)的表達效果。同時采用固定化酶、模擬移動床分離技術(shù)以及結(jié)晶，獲得純度99.1%的D-阿洛酮糖。

其他菌株如sp. 8437[40]、鮑氏梭菌ATCC BAA-613[36]、密螺旋體屬細菌ZAS-1[41]、伯克霍爾德氏菌sp. MR1[42]和普氏梭桿菌[43]均被報道具有DPEase活性。Jia等[36]對鮑氏梭菌ATCC BAA-613進行全細胞反應(yīng)，確定該菌株具有催化D-果糖差向異構(gòu)生成D-阿洛酮糖的能力，同時將DPEase基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800中表達，無需外源添加誘導(dǎo)劑即可產(chǎn)生DPEase。當反應(yīng)進行18 h時，酶活可達6.8 U/mL，其最適pH為7.0，最適溫度為55 ℃。Zhang等[40]利用sp.來源的DPEase，以500 g/L的D-果糖為底物，可獲得142.5 g/L的D-阿洛酮糖。來源的DPEase在最適條件 (pH 8.0，70 ℃) 下，利用同樣的底物濃度 (500 g/L)，D-阿洛酮糖的產(chǎn)量為137.5 g/L[41]。

2.3 其他酮糖3-差向異構(gòu)酶

2007年，Oh研究團隊從土壤中篩選得到一株可轉(zhuǎn)化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的根瘤屬細菌，發(fā)現(xiàn)其細胞粗提物在催化反應(yīng)中顯示出不同于DTEase和DPEase的性質(zhì)，推測使D-果糖發(fā)生差向異構(gòu)反應(yīng)產(chǎn)生D-阿洛酮糖的酶可能是酮糖3-差向異構(gòu)酶家族的新成員。利用該根瘤菌滲透化細胞，在pH為8.5、溫度為40 ℃以及60 mg/mL的細胞濃度下全細胞轉(zhuǎn)化15 h后，D-果糖的轉(zhuǎn)化率為70%[44]。近年來，測序技術(shù)的快速發(fā)展為DTEase同系物的快速篩選奠定了基礎(chǔ)，特別是為篩選熱穩(wěn)定性強的異構(gòu)酶提供了指導(dǎo)。熱穩(wěn)定性酶參與機體碳源代謝，能夠很好地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[45]。Sakuraba等[46]篩選得到極端嗜熱菌海棲熱袍菌來源的D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶相關(guān)的蛋白 (TM0416p)，其單體的主體結(jié)構(gòu)與菊芋假單胞菌來源的DTEase和根癌農(nóng)桿菌來源的DTEase具有一定的相似性，但表現(xiàn)特殊的溶劑和底物結(jié)合區(qū)域，從而缺乏一個可覆蓋活性位點間隙的α-螺旋。另外，圍繞底物營造疏水環(huán)境的殘基與上述兩個酶也完全不同。因此，推測TM0416p和其他酮糖3-差向異構(gòu)酶具有本質(zhì)的區(qū)別。

表1 不同微生物來源酮糖3-差向異構(gòu)酶的比較

除此之外，專利中也報道一些可將果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的3-差向異構(gòu)酶。例如，安信惠等[47]公布了一種使用粘著劍菌菌株SYG29生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法。利用該細胞、細胞培養(yǎng)物或細胞裂解物，其最適pH為7.0–9.0，在60 ℃條件下細胞細胞活性半衰期為7.6 h，添加Mn2+和Co2+轉(zhuǎn)化活性相對較高。在70 ℃反應(yīng)6 h后，最大D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率約為26%。

3 酮糖3-差向異構(gòu)酶的晶體結(jié)構(gòu)

目前已知晶體結(jié)構(gòu)的具有將果糖轉(zhuǎn)化成阿洛酮糖功能的差向異構(gòu)酶有3種，分別是來源于根癌農(nóng)桿菌的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶 (DPEase)[48]、來源于解纖維梭菌的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶DPEase[49]以及菊芋假單胞菌的D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶 (DTEase)[50]。本文結(jié)合3個酶的結(jié)構(gòu)，對其序列、整體結(jié)構(gòu)、活性中心、底物結(jié)合、催化機理及底物選擇性等方面進行了比較和分析。

3.1 序列分析

多重序列比對結(jié)果表明，DPEase、DPEase和DTEase具有高度的序列一致性 (圖3)，其中DPEase與DPEase和DTEase的序列一致性分別為61%和40%，活性位點殘基 (包括金屬結(jié)合位點和底物結(jié)合位點) 高度保守。

圖3 CCH10DPEase、PcDTEase和AtDPEase的多重序列比對結(jié)果

3.2 整體結(jié)構(gòu)比較

如圖4A所示，DPEase、DPEase和DTEase在溶液中都是以不對稱的四聚體形式存在。DPEase與DPEase的單體和二聚體的聚合方式相似，而DTEase與這兩個酶不同，兩個二聚體之間形成一個15°的夾角，使得DTEase內(nèi)二聚體的相互作用區(qū)域變大，而這個大的內(nèi)亞基相互作用區(qū)域使得DTEase的結(jié)構(gòu)比DPEase和DPEase更穩(wěn)定，導(dǎo)致DTEase的熱穩(wěn)定性更高。因此，DTEase的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，而DPEase和DPEase的最適反應(yīng)溫度分別為50 ℃和55 ℃。

圖4B顯示了DPEase的亞基A (綠色) 和亞基D (黃色) 之間形成的二聚體界面，其中形成主要相互作用的有11個氨基酸殘基 (Y116、K122、R154、N188、E190、D192、N214、K216、R222、W260和R261)，這些殘基能夠在兩個亞基之間形成直接的氫鍵作用，共形成了34個氫鍵。如圖3所示，這些氨基酸殘基在3個酶中也高度保守。

如圖4C所示，DPEase和DTEase的每個亞基都是由11個α螺旋和8個β折疊形成一個(β/α)8的TIM-桶結(jié)構(gòu)；而DPEase的亞基是由12個α螺旋和8個β折疊形成一個(β/α)8的TIM-桶結(jié)構(gòu)。此外，結(jié)構(gòu)顯示，DPEase、DTEase和DPEase的活性中心都含有一個金屬離子。

3.3 金屬結(jié)合位點比較

三種酶在催化過程中都需要金屬離子，金屬離子在酶中以扭曲的八面體形式存在，通過6個配位鍵與酶形成相互作用。金屬離子與4個保守的氨基酸殘基 (E150、D183、H209和E244) 和2個水分子形成相互作用 (圖3和圖5)。

圖4 CCH10DPEase、PcDTEase和AtDPEase的晶體結(jié)構(gòu)

圖5 CCH10DPEase、PcDTEase和AtDPEase的金屬結(jié)合位點結(jié)構(gòu)

3.4 催化活性位點比較

DPEase、DTEase和DPEase與底物D-果糖的復(fù)合物結(jié)構(gòu)疊加圖見圖6。D-果糖O1、O2和O3與3種酶的相互作用很相似，在4、5和6位發(fā)現(xiàn)明顯的差異。由于電子云密度較弱，雖然很難比較這3個位點分子構(gòu)象的細節(jié)變化，但是仍然能夠比較出底物的位置。DPEase與DPEase類似，在這兩個酶中，D-果糖的O6與主鏈Ile66和Ala107形成氫鍵。在DTEase中，D-果糖相對于其他兩個酶的構(gòu)象，圍繞C2發(fā)生逆時針20°的旋轉(zhuǎn)，并且位于疏水口袋的中心，與Cys66形成氫鍵作用。在DTEase中，D-果糖避免了與Leu108 (DPEase與DPEase中的Ala107) 形成短相互作用，并且在Leu108的反向，DPEase與DPEase的Tyr6伸向結(jié)合在活性口袋中的底物。因此，DTEase與DPEase和DPEase疏水口袋的形狀和疏水性不同，分別是Phe7/Tyr6、Cys66/Gly65和Leu108/Ala107。因此，DTEase與DPEase和DPEase具有不同的底物特異性和親和性。

圖6 CCH10DPEase、PcDTEase和AtDPEase與D-果糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)疊加圖[48]

基于晶體結(jié)構(gòu)及序列比對的結(jié)果，3種酶具有相似的催化機制。Chan等[49]推測DPEase催化機制如圖7所示：首先，其中一個Glu殘基(E150和E244) 與Mn離子結(jié)合，然后移除C3的質(zhì)子，產(chǎn)生一個cis-enediolate中間體，最后另外一個Glu殘基從相反方向?qū)3重新質(zhì)子化，完成兩者之間的轉(zhuǎn)化。綜上，通過對酮糖3-差向異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)的解析，為基于蛋白質(zhì)工程技術(shù)，提高酶的活性及D-果糖生成D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化效率提供重要理論依據(jù)。

圖7 推測的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的催化機制[49]

4 討論

動物實驗顯示，絕大多數(shù)D-阿洛酮糖不被機體吸收，但可通過多種途徑介導(dǎo)機體的脂代謝、血糖代謝以及抗氧化作用，從而減少體內(nèi)脂肪沉積，降低血糖水平[7,10-20]。然而被機體吸收的D-阿洛酮糖在腸道內(nèi)的代謝方式，以及D-阿洛酮糖對人體各項機能的影響還有待進一步研究。隨著對下游D-阿洛酮糖應(yīng)用研究的逐漸深入，上游D-阿洛酮糖的高效生物合成也一直是研究者的目標。國內(nèi)關(guān)于D-阿洛酮糖的研究工作起步較晚，主要進行了菌種篩選、酶基因克隆和酶的固定化研究等。由于酶的高度選擇性、特異性以及反應(yīng)溫和和環(huán)境友好等特點，使得生物催化方法較化學(xué)合成方法制備D-阿洛酮糖具有較明顯的優(yōu)勢。針對D-阿洛酮糖的生物合成需解決以下3個方面的關(guān)鍵問題：第一，目前報道的酮糖3-差向異構(gòu)酶產(chǎn)生菌多不是GRAS，可能存在安全隱患，因此需要將相關(guān)的酶轉(zhuǎn)入GRAS宿主并實現(xiàn)高效表達。目前，本實驗室利用Huang等[52]建立的枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)，可實現(xiàn)外源DPEase基因的高效表達 (未發(fā)表)。第二，生物合成過程多涉及兩種糖之間差向異構(gòu)化的化學(xué)平衡問題，因而可能會面臨產(chǎn)率較低或分離純化難等問題。鑒于此，可采用雙酶偶聯(lián)或工藝改善等手段，提高生產(chǎn)效率和效益。第三，現(xiàn)有的差向異構(gòu)酶在最適反應(yīng)條件下熱穩(wěn)定性較低?？赏ㄟ^在自然界極端環(huán)境篩選優(yōu)良菌株，或結(jié)合酮糖3-差向異構(gòu)酶家族晶體結(jié)構(gòu)的信息，進行基因改造，改善酶的反應(yīng)活性和熱穩(wěn)定性。王小艷等[53]基于PGUS-P模擬結(jié)構(gòu)分析，采用半理性方法設(shè)計并通過定點突變引入新的N-糖基化位點，經(jīng)畢赤酵母重組表達后得到了系列糖基化突變酶，顯示其對底物甘草酸的親和力和催化效率均得到提高，同時熱穩(wěn)定性也得到顯著改善。綜上，為滿足D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)需求，采用生物技術(shù)與工藝過程優(yōu)化等多種方式相結(jié)合的策略，著力解決上述關(guān)鍵問題。

5 展望

隨著經(jīng)濟水平的提高，居民的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂等慢性病在全球范圍內(nèi)大流行[1]。因此，人們在飲食中越來越注重糖分的“健康攝取”，促使低熱量甜味劑展示了廣闊的應(yīng)用前景。2011年FDA認可甜味劑D-阿洛酮糖可以作為食品添加劑使用[6]。自此，D-阿洛酮糖得到了迅速發(fā)展，國外市場上出現(xiàn)了多種含D-阿洛酮糖的產(chǎn)品。盡管我國對D-阿洛酮糖的研究起步較晚，市場尚未開發(fā)，但隨著對其生理功能研究和臨床試驗探索的逐步深入，D-阿洛酮糖將具有更加廣泛的市場價值。同時，隨著合成生物學(xué)、基因工程、代謝工程和測序技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合本單位已建立的商品糖生產(chǎn)線，為D-阿洛酮糖的工業(yè)生產(chǎn)提供了可能，從而填補國內(nèi)空白。

[1] NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Trends in adult body-mass index in 200 countries from 1975 to 2014: a pooled analysis of 1698 population-based measurement studies with 19·2 million participants. Lancet, 2016, 387(10026): 1377–1396.

[2] Bommer C, Heesemann E, Sagalova V, et al. The global economic burden of diabetes in adults aged 20–79 years: a cost-of-illness study. Lancet Diabetes Endocrinol, 2017, 5(6): 423–430.

[3] Matsuo T, Suzuki H, Hashiguchi M, et al. D-psicose is a rare sugar that provides no energy to growing rats. J Nutrit Sci Vitaminol, 2002, 48(1): 77–80.

[4] Baek SH, Kwon SY, Lee HG, et al. Maillard browning reaction of D-psicose as affected by reaction factors. Food Sci Biotechnol, 2008, 17(6): 1349–1351.

[5] Mu WM, Zhang WL, Feng YH, et al. Recent advances on applications and biotechnological production of D-psicose. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 94(6): 1461–1467.

[6] GRAS Notice Inventory. Agency Response Letter GRAS Notice No. GRN 000400. [2017-10-17]. https://www. fda.gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/GRAS/NoticeInventory.

[7] Tsukamoto I, Hossain A, Yamaguchi F, et al. Intestinal absorption, organ distribution, and urinary excretion of the rare sugar D-psicose. Drug Des Devel Ther, 2014, 8: 1955–1964.

[8] Matsuo T, Tanaka T, Hashiguchi M, et al. Metabolic effects of D-psicose in rats: studies on faecal and urinary excretion and caecal fermentation. Asia Pac J Clin Nutr, 2003, 12(2): 225–231.

[9] Iida T, Hayashi N, Yamada T, et al. Failure of d-psicose absorbed in the small intestine to metabolize into energy and its low large intestinal fermentability in humans. Metabolism, 2010, 59(2): 206–214.

[10] Hossain A, Yamaguchi F, Hirose K, et al. Rare sugar D-psicose prevents progression and development of diabetes in T2DM model Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty rats. Drug Des Devel Ther, 2015, 9: 525–535.

[11] Shintani T, Yamada T, Hayashi N, et al. Rare sugar syrup containing D-allulose but not high-fructose corn syrup maintains glucose tolerance and insulin sensitivity partly via hepatic glucokinase translocation in wistar rats. J Agric Food Chem, 2017, 65(13): 2888–2894.

[12] Hossain MA, Kitagaki S, Nakano D, et al. Rare sugar D-psicose improves insulin sensitivity and glucose tolerance in type 2 diabetes Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 405(1): 7–12.

[13] Hossain A, Yamaguchi F, Matsunaga T, et al. Rare sugar D-psicose protects pancreas β-islets and thus improves insulin resistance in OLETF rats. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 425(4): 717–723.

[14] Chung YM, Hyun Lee J, Youl Kim D, et al. Dietary D-psicose reduced visceral fat mass in high-fat diet-induced obese rats. J Food Sci, 2012, 77(2): H53–H58.

[15] Nagata Y, Kanasaki A, Tamaru S, et al. D-psicose, an epimer of D-fructose, favorably alters lipid metabolism in Sprague-Dawley rats. J Agric Food Chem, 2015, 63(12): 3168–3176.

[16] Kim SJ, Sung MK, Kim SE, et al. Dietary D-psicose in substitution for sucrose influences adipose tissue metabolism in a mouse model of obesity. FASEB J, 2015, 29 (1 Supplement).

[17] Han YJ, Han HJ, Kim AH, et al. D-Allulose supplementation normalized the body weight and fat-pad mass in diet-induced obese mice via the regulation of lipid metabolism under isocaloric fed condition. Mol Nutr Food Res, 2016, 60(7): 1695–1706.

[18] Kimura T, Kanasaki A, Hayashi N, et al. D-Allulose enhances postprandial fat oxidation in healthy humans. Nutrition, 2017, 43–44: 16–20.

[19] Iida T, Kishimoto Y, Yoshikawa Y, et al. Acute D-psicose administration decreases the glycemic responses to an oral maltodextrin tolerance test in normal adults. J Nut Sci Vitaminol, 2008, 54(6): 511–514.

[20] Matsuo T, Izumori K. D-psicose inhibits intestinal α-glucosidase and suppresses the glycemic response after ingestion of carbohydrates in rats. J Clin Biochem Nutr, 2009, 45(2): 202–206.

[21] Hayashi N, Iida T, Yamada T, et al. Study on the postprandial blood glucose suppression effect of D-psicose in borderline diabetes and the safety of long-term ingestion by normal human subjects. Biosci Biotechnol Biochem, 2010, 74(3): 510–519.

[22] Hossain A, Yamaguchi F, Matsuo T, et al. Rare sugar D-allulose: potential role and therapeutic monitoring in maintaining obesity and type 2 diabetes mellitus. Pharmacol Ther, 2015, 155: 49–59.

[23] Murata A, Sekiya K, Watanabe Y, et al. A novel inhibitory effect of D-allose on production of reactive oxygen species from neutrophils. J Biosci Bioeng, 2003, 96: 89–91.

[24] Iwasaki Y, Sendo M, Dezaki K, et al. GLP-1 release and vagal afferent activation mediate the beneficial metabolic and chronotherapeutic effects of D-allulose. Nat Commun, 2018, 9: 113.

[25] Izumori K, Yamakita M, Tsumura T, et al. Production of D-psicose from D-talitol, D-tagatose or D-galactitol bysp. 701B. J Ferment Bioeng, 1990, 70(1): 26–29.

[26] Ishida Y, Kamiya T, Izumori K. Production of D-tagatose 3-epimerase ofST-24 using recombinant. J Ferment Bioeng, 1997, 84(4): 348–350.

[27] Takeshita K, Suga A, Takada G, et al. Mass production of D-psicose from D-fructose by a continuous bioreactor system using immobilized D-tagatose 3-epimerase. J Biosci Bioeng, 2000, 90(4): 453–455.

[28] Zhang LT, Mu WM, Bo J, et al. Characterization of D-tagatose-3-epimerase fromthat converts D-fructose into D-psicose. Biotechnol Lett, 2009, 31(6): 857–862.

[29] Zhang WL, Fang D, Xing QC, et al. Characterization of a novel metal-dependent D-psicose 3-epimerase from35704. PLoS ONE, 2013, 8(4): e62987.

[30] Yoshihara A, Kozakai T, Shintani T, et al. Purification and characterization of D-allulose 3-epimerase derived fromM30, a GRAS microorganism. J Biosci Bioeng, 2017, 123(2): 170–176.

[31] Kim HJ, Hyun EK, Kim YS, et al. Characterization of anD-psicose 3-epimerase that converts D-fructose to D-psicose. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(2): 981–985.

[32] Choi JG, Ju YH, Yeom SJ, et al. Improvement in the thermostability of D-psicose 3-epimerase from Aby random and site-directed mutagenesis. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(20): 7316–7320.

[33] Park CS, Park CS, Shin KC, et al. Production of D-psicose from D-fructose by whole recombinant cells with high-level expression of d-psicose 3-epimerase from. J Biosci Bioeng, 2016, 121(2): 186–190.

[34] Mu WM, Chu FF, Xing QC, et al. Cloning, expression, and characterization of a D-psicose 3-epimerase fromH10. J Agric Food Chem, 2011, 59(14): 7785–7792.

[35] Li XB, Zhu YM, Zeng Y, et al. Overexpression of D-psicose 3-epimerase fromH10 inand its prospect for D-psicose production. Adv J Food Sci Technol, 2013, 5(3): 264–269.

[36] Jia M, Mu WM, Zhang T, et al. Expression of D-Psicose 3-epimerase in. J Food Sci Biotechnol, 2014, 33(11): 1129–1135.

[37] Yang JG, Li JT, Men Y, et al. Biosynthesis of L-sorbose and L-psicose based on C—C bond formation catalyzed by aldolases in an engineeredstrain. Appl Environ Microbiol, 2015, 81(13): 4284–4294.

[38] Yang JG, Zhu YM, Yan M, et al. Pathway construction inand strain engineering to produce rare sugars from glycerol. J Agric Food Chem, 2016, 64(50): 9497–9505.

[39] Li C, Lin JQ, Guo QQ, et al. D-Psicose 3-epimerase secretory overexpression, immobilization, and D-psicose biotransformation, separation and crystallization. J Chem Technol Biotechnol, 2017, 93(2): 350–357.

[40] Zhang WL, Fang D, Zhang T, et al. Characterization of a metal-dependent D-psicose 3-epimerase from a novel strain,sp. 8437. J Agric Food Chem, 2013, 61(47): 11468–11476.

[41] Zhang WL, Zhang T, Jiang B, et al. Biochemical characterization of a D-psicose 3-epimerase fromZAS-1 and its application on enzymatic production of D-psicose. J Sci Food Agric, 2016, 96(1): 49–56.

[42] Wu HG, Yu YD, Zhu J, et al. DPE deriving fromand application thereof: China, CN106119235A. 2016-11-16 (in Chinese). 吳會廣, 余允東, ?？? 等. 一種來源于伯克霍爾德氏菌的DPE及其應(yīng)用: 中國, CN106119235A. 2016-11-16.

[43] Kim TG, Kim MS, Kim TY, et al. Psicose epimerase and psicose production method using same: China, CN106164265A. 2016-11-23 (in Chinese). 金泰均, 金玟秀, 金泰龍, 等. 阿洛酮糖差向異構(gòu)酶和使用它生產(chǎn)阿洛酮糖的方法: 中國, CN106164265A. 2016-11-23.

[44] Oh DK, Kim NH, Kim HJ, et al. D-Psicose production from D-fructose using an isolated strain,sp. World J Microbiol Biotechnol, 2007, 23(4): 559–563.

[45] Lee DW, Jang HJ, Choe EA, et al. Characterization of a thermostable L-arabinose (D-galactose) isomerase from the hyperthermophilic eubacterium. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(3): 1397–1404.

[46] Sakuraba H, Yoneda K, Satomura T, et al. Structure of a D-tagatose 3-epimerase-related protein from the hyperthermophilic bacterium. Acta Cryst, 2009, 65(3): 199–203.

[47] Ahn SH, Kim HJ, Han EJ, et al.sp. strain and method for producing psicose using same: China, CN105849261A. 2016-08-10 (in Chinese). 安信惠, 金慧貞, 韓恩珍, 等. 劍菌屬菌株和使用其生產(chǎn)阿洛酮糖的方法: 中國, CN105849261A. 2016-08-10.

[48] Kim K, Kim HJ, Oh DK, et al. Crystal structure of D-psicose 3-epimerase fromand its complex with true substrate D-fructose: a pivotal role of metal in catalysis, an active site for the non-phosphorylated substrate, and its conformational changes. J Mol Biol, 2006, 361(5): 920–931.

[49] Chan HC, Zhu YM, Hu YM, et al. Crystal structures of D-psicose 3-epimerase fromH10 and its complex with ketohexose sugars. Protein Cell, 2012, 3(2): 123–131.

[50] Yoshida H, Yamada M, Nishitani T, et al. Crystal structures of D-tagatose 3-epimerase fromand its complexes with D-tagatose and D-fructose. J Mol Biol, 2007, 374(2): 443–453.

[51] Robert X, Gouet P. Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server. Nucleic Acids Res, 2014, 42(Web Server issue): W320–W324.

[52] Huang XL, Li Z, Du CY, et al. Improved expression and characterization of a multidomain xylanase fromSCUT27 in. J Agric Food Chem, 2015, 63(28): 6430–6439.

[53] Wang XY, Fan YS, Han BJ, et al. Improvement of thermostability of recombinant β-glucuronidase by glycosylation. CIESC J, 2015, 66(9): 3669–3677 (in Chinese). 王小艷, 樊艷爽, 韓蓓佳, 等. 糖基化改造β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性. 化工學(xué)報, 2015, 66(9): 3669–3677.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Research progress of D-psicose: function and its biosynthesis

Xuemei Shen1,2,3*, Jing Wang1,2,3*, Yuan Zhang1,2,3, Xiaoyan Wang1,2,3, Ziyuan Ding1,2,3, Yi Li4, Bo Chen1,2,3, and Yi Tong4

1 Nutrition & Health Research Institute, China National Cereals, Oils and Foodstuffs Corporation (COFCO), Beijing 102209, China2 Beijing Key Laboratory of Nutrition, Health and Food Safety, Beijing 102209, China3 Beijing Engineering Laboratory for Geriatric Nutrition Food Research, Beijing 102209, China4 Jilin COFCO Biochemistry Co., Ltd.(National Engineering Research Center of Corn Deep Processing), Changchun 130033, Jilin, China

As the morbidity of metabolic syndrome like obesity and diabetes increases rapidly worldwide, the issue of nutrition (functional food) and health has drawn more attention. D-psicose, a rare natural ketohexose, has become a hot topic in functional food and health-care field because of its hypoglycemic and hypolipidemic function with good sweetness. This article mainly discusses the functional properties and biosynthesis research progress of D-psicose, together with the crystal structure of ketose-3-epimerase, to provide theoretical guidance for D-psicose-producing strain screening as well as improving the thermostability and catalytic efficiency of ketose-3-epimerase for industrial application.

D-psicose, function, synthesis, epimerase, reactivity, stability

December28, 2017;

April 3, 2018

Science and Technology Development Plan of Jilin Province (No. 20150203005NY).

Yi Tong. Tel: +86-431-85883017; Fax: +86-10-56989555; E-mail: tongyi@cofco.com

10.13345/j.cjb.170526

*These authors contributed equally to this study.

吉林省科技發(fā)展計劃項目 (No. 20150203005NY) 資助。