兩相體系中全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法制備托莫西汀中間體

， ，泮佳

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

兒童注意缺陷多動障礙(Attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)是一種兒童時期常見的神經(jīng)精神障礙，在學(xué)齡兒童中的發(fā)病率高達(dá)6%～10%，主要表現(xiàn)為注意力分散、活動過度和沖動[1].鹽酸托莫西汀(Atomoxetine hydrochloride，ATX)是目前唯一獲FDA批準(zhǔn)可用于ADHD兒童、青少年與成人患者的非神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑藥[2].

(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯是(R)-托莫西汀的重要中間體，可通過微生物轉(zhuǎn)化法制備[3].微生物轉(zhuǎn)化法反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少、收率高、光學(xué)純度高和環(huán)境友好[4-5].對于需要輔酶參與的合成反應(yīng)，采用添加低廉的碳源或醇類的方式，就可實現(xiàn)輔酶的再生[6].同時，利用磷酸鹽緩沖液/有機(jī)溶劑兩相體系，擴(kuò)大了難溶于水的底物3-羰基-3-苯基丙酸乙酯的溶解度，提高底物的利用率.這一過程中最關(guān)鍵的是確定合適的有機(jī)溶劑和磷酸鹽緩沖液組成的兩相體系.在兩相體系中，有機(jī)溶劑對微生物的毒害作用，可導(dǎo)致細(xì)胞失活和酶結(jié)構(gòu)破壞，影響生物催化的進(jìn)行.研究了在磷酸鹽緩沖液/有機(jī)溶劑兩相體系中，以熱帶假絲酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016作為催化劑，不對稱還原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制備(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的過程.考察了不同有機(jī)溶劑對CandidatropicalisCGMCC NO.15016的細(xì)胞毒性，以及對細(xì)胞不同生長期的毒性和底物對微生物代謝的影響.在此基礎(chǔ)上，筆者詳細(xì)探討了不同有機(jī)溶劑對底物的轉(zhuǎn)化率以及產(chǎn)物對映體過剩值的影響，同時對影響反應(yīng)的各種因素例如相體積比、輔助底物、磷酸緩沖液pH、溫度、菌體濃度和底物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化[7-9]，最終確定了最佳反應(yīng)條件.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

熱帶假絲酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016，由本實驗室從浙江工業(yè)大學(xué)校園土壤中篩選得到，并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心.

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，硫酸銨1 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，氯化鈉1 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，瓊脂20 g/L.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖46 g/L，酵母汁25 g/L，磷酸二氫鉀4 g/L，磷酸氫二鉀4 g/L，氯化鈉0.1 g/L.

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖46 g/L，酵母汁25 g/L，磷酸二氫鉀4 g/L，磷酸氫二鉀4 g/L，氯化鈉0.1 g/L.

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：30 ℃，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d.

種子培養(yǎng)：將斜面接入裝液25 mL種子培養(yǎng)基的100 mL三角錐形瓶中，于30 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h.

發(fā)酵培養(yǎng)：將已培養(yǎng)24 h的種子液，以10%的接種量接入裝液250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1 000 mL三角錐形瓶中，于30 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h.

1.2.2 有機(jī)溶劑對細(xì)胞毒性的檢測方法

DNS溶液的配制：3,5-二硝基水楊酸，1%；苯酚，0.2%；亞硫酸鈉，0.05%；氫氧化鈉，1%；酒石酸鈉鉀，20%.配制好DNS溶液，將其保存在棕色瓶中避光穩(wěn)定一周后使用[10].

代謝活力保留值(Metabolic activity retention，R%)計算方法：稱取干重為0.5 g的經(jīng)過離心獲得的濕菌體于50 mL錐形瓶中，加入10 mL無菌水和10 mL有機(jī)溶劑，稱取干重為0.5 g的經(jīng)過離心獲得的濕菌體于50 mL錐形瓶中加入20 mL無菌水作為對照組，在30 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h后離心，棄去上清液得菌體沉淀，將菌體沉淀加入20 g/L的10 mL葡萄糖溶液中培養(yǎng)4 h后，離心取上清液.用DNS法測葡萄糖濃度，將其與初始葡萄糖濃度相比，得到耗糖量.微生物細(xì)胞的代謝活力保留定義[11]為

R=(R1/R2)×100%

(1)

式中R1，R2分別為兩相體系中和無菌水中培養(yǎng)24 h的菌體在葡萄糖溶液中培養(yǎng)4 h時的耗糖量.細(xì)胞的代謝活力保留值R的大小可用來表征有機(jī)溶劑的毒性大小，其值越大，說明該有機(jī)溶劑對微生物細(xì)胞的毒性越小，其生物相容性越好.

1.2.3 3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制備(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的分析方法

采用島津GC-2014氣相色譜儀檢測產(chǎn)物和底物的濃度.GC檢測條件：手性柱 supelcoβ-120(250 mm×2.5 mm)；進(jìn)樣量1 μL；柱溫125 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測口溫度255 ℃；載氣為氮?dú)?；載氣流量2 mL/min；分流比1∶15；檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID).

底物3-羰基-3-苯基丙酸乙酯和產(chǎn)物(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的出峰時間分別為17.815 min和27.182 min，如圖1所示.

圖1 底物和產(chǎn)物的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatography of the substrate and product

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法

底物摩爾轉(zhuǎn)化率的計算式為

(2)

式中：P為反應(yīng)結(jié)束時產(chǎn)物的質(zhì)量；Mp為產(chǎn)物的分子量；Ms為底物的分子量；q為反應(yīng)初始時底物的質(zhì)量.

產(chǎn)物對映體過剩值的計算式為

(3)

式中：CR為R-構(gòu)型產(chǎn)物的摩爾濃度；CS為S-構(gòu)型產(chǎn)物的摩爾濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)溶劑對Candida tropicalis CGMCCNO.15016毒性研究

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確配制0.2～1.6 g/L質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，測定550 nm處的吸光度，在相同條件下繪制出吸光度隨葡萄糖質(zhì)量濃度變化的曲線圖,如圖2所示.

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose solution

2.1.2 不同有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒性

選用9種有機(jī)溶劑探討了熱帶假絲酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016在磷酸鹽緩沖液和這些有機(jī)溶劑組成的兩相體系中培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞代謝活力.細(xì)胞的代謝活力保留值R越大，說明該有機(jī)溶劑對微生物細(xì)胞的毒性越小，生物相容性越好，實驗結(jié)果如表1所示.熱帶假絲酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016細(xì)胞在鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯中的糖代謝活力保留值最高，均達(dá)到了100%以上，說明這些有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒性小，生物相容性高.

表1不同有機(jī)溶劑中細(xì)胞代謝活力值

Table1Cellularmetabolicactivityvaluesindifferentorganicsolvents

溶劑logPR/%正己烷3.5068.1正庚烷4.0075.2鄰苯二甲酸二乙酯3.3061.9鄰苯二甲酸二丁酯5.40100.4鄰苯二甲酸二辛酯9.60100.1乙酸乙酯0.649.8正丁醇0.808.3正辛醇2.9037.3乙酸丁酯1.7015.4

2.1.3 細(xì)胞的代謝活力與log P值關(guān)系

有機(jī)溶劑的logP值是有機(jī)溶劑在1-辛醇與水中的分配比的對數(shù)值，是有機(jī)溶劑的特征參數(shù)[12].logP值越大，說明疏水性越強(qiáng)，反之亦然.為了直觀反映logP值與細(xì)胞代謝活力的關(guān)系，以表1中l(wèi)ogP值為橫坐標(biāo)，以R為縱坐標(biāo)繪制兩者關(guān)系圖.圖3表明：細(xì)胞的代謝活力與logP值的關(guān)系大體呈S型曲線.細(xì)胞在logP<2的有機(jī)溶劑中時，細(xì)胞的代謝活力很低；細(xì)胞在logP為2～4的有機(jī)溶劑中時，具有中等的代謝活力值；當(dāng)細(xì)胞在logP>4的有機(jī)溶劑中時，細(xì)胞的代謝活力能達(dá)到85%以上，說明該有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒性較小，具有良好的生物相容性.因此，可以用logP來衡量有機(jī)溶劑對熱帶假絲酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016細(xì)胞的毒性和生物相容性.

圖3 有機(jī)溶劑log p值與細(xì)胞代謝活力的關(guān)系Fig.3 Relationship between the logP value of organic solvent and the cell metabolic activity

2.1.4 有機(jī)溶劑對不同生長期細(xì)胞的毒性

考察了熱帶假絲酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016不同生長期(3個)的細(xì)胞在磷酸鹽緩沖液/有機(jī)溶劑兩相體系的細(xì)胞代謝活力，3個時期分別為生長期(24 h)、穩(wěn)定期(40 h)和衰退期(60 h)，實驗結(jié)果如表2所示.處于生長期的細(xì)胞的代謝活力值都比穩(wěn)定期和衰退期的低，而穩(wěn)定期和衰退期的細(xì)胞代謝活力值變化不大.

表2有機(jī)溶劑對不同生長期細(xì)胞的代謝活力的影響

Table2Influenceofthedifferentorganicsolventsonmetabolicactivityofcellsatdifferentgrowthphase

培養(yǎng)時間/hR/%正丁醇乙酸丁酯鄰苯二甲酸二丁酯正己烷正庚烷246.110.987.954.463.74011.718.398.675.584.86014.223.1101.380.678.7

2.1.5 底物對細(xì)胞代謝活力的影響

研究了在3-羰基-3-苯基丙酸乙酯的不同質(zhì)量濃度下，熱帶假絲酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016的細(xì)胞代謝活力值.由圖4可知：質(zhì)量濃度對細(xì)胞代謝有一定的影響，底物的質(zhì)量濃度越高，細(xì)胞的代謝活力值越小，說明高質(zhì)量濃度的底物對細(xì)胞的毒性更大.

圖4 不同底物質(zhì)量濃度對細(xì)胞代謝活力值的影響Fig.4 Influence of various concentration of substrate on metabolic activity of cells

2.2 Candida tropicalis CGMCC NO.15016不對稱還原轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

2.2.1 有機(jī)溶劑的選擇

選擇合適的有機(jī)溶劑是兩相體系中進(jìn)行生物催化的關(guān)鍵，實驗中研究了不同有機(jī)溶劑和磷酸鹽緩沖液組成的兩相體系中的生物催化效果，結(jié)果如表3所示.在鄰苯二甲酸二丁酯和磷酸鹽緩沖液組成的兩相體系中轉(zhuǎn)化率達(dá)到了最大值，同時鄰苯二甲酸二丁酯對熱帶假絲酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016毒性較小.在各個不同有機(jī)溶劑中得到的產(chǎn)物(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均為100%.選擇了磷酸鹽緩沖液/鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系作為后續(xù)實驗的反應(yīng)介質(zhì).

表3 不同有機(jī)溶劑對反應(yīng)的影響Table 3 Effect of various organic solvents on reduction %

2.2.2 不同相體積比對反應(yīng)的影響

考察了磷酸鹽緩沖液/鄰苯二甲酸二丁酯不同體積比對底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物對映體過剩值的影響，實驗結(jié)果如圖5所示，其中：Va為水相的體積；Vb為鄰苯二甲酸二丁酯的體積.隨著鄰苯二甲酸二丁酯體積的不斷增加，轉(zhuǎn)化率隨之增加，當(dāng)Va∶Vb=1∶1時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了最大值，之后隨著有機(jī)溶劑的增加轉(zhuǎn)化率大幅度下降.在各個不同相體積比下得到的產(chǎn)物(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均為100%.磷酸鹽緩沖液與鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系最適宜的相體積比為1∶1.

圖5 不同相體積比對反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of volume ratio on reduction

2.2.3 不同輔助底物對反應(yīng)的影響

不對稱還原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制備(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的過程反應(yīng)式為

(4)

不對稱還原過程中，添加輔助底物有利于輔酶的再生和循環(huán)利用.因此，研究了體積分?jǐn)?shù)分別為0%，2%，4%，6%，8%，10%的異丙醇、乙醇、甘油和葡萄糖作為輔助底物對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響，實驗結(jié)果如圖6所示.加入葡萄糖和乙醇為輔助底物時，轉(zhuǎn)化率都有所提高，且乙醇比葡萄糖對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響更大，加入8%的乙醇最有利于輔酶的再生，輔酶再生機(jī)理見式(4).乙醇在酵母細(xì)胞中的乙醇脫氫酶作用下生成乙醛，脫下的H+轉(zhuǎn)移給NAD+生成NADH.在添加不同種類及不同添加量的輔助底物的情況下，得到的產(chǎn)物(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均為100%.故8%添加量的乙醇是最適宜的輔助底物.

圖6 不同體積分?jǐn)?shù)輔助底物對反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of co-substrate on reduction

2.2.4 不同溫度對反應(yīng)的影響

在最佳的反應(yīng)溫度下，菌體細(xì)胞可以表現(xiàn)出很高的催化活性.考察了在20～40 ℃時溫度對底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物對映體過剩值的影響，實驗結(jié)果如圖7所示.當(dāng)溫度由20 ℃增加到36 ℃時，轉(zhuǎn)化率明顯增大；當(dāng)溫度超過36 ℃時，隨著溫度的繼續(xù)升高，轉(zhuǎn)化率開始下降.在各個不同溫度下得到的產(chǎn)物(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均為100%.選擇最佳的反應(yīng)溫度為36 ℃.

圖7 不同反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of temperature on reduction

2.2.5 磷酸鹽緩沖液pH不同對反應(yīng)的影響

研究了磷酸鹽緩沖液pH的范圍在3～8，不同pH的緩沖液對酶促反應(yīng)的影響，實驗結(jié)果如圖8所示.當(dāng)pH由3增加到6時，底物的轉(zhuǎn)化率不斷增大；當(dāng)pH超過6時，轉(zhuǎn)化率不斷降低.該結(jié)果表明磷酸鹽緩沖液pH=6時細(xì)胞具有較大的催化活性.在各個不同pH下得到的產(chǎn)物(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均為100%.磷酸鹽緩沖液/有機(jī)溶劑兩相體系中緩沖液最適宜的pH=6.

圖8 不同pH對反應(yīng)的影響Fig.8 Effect of pH value on reduction

2.2.6 不同菌體質(zhì)量濃度對反應(yīng)的影響

保持底物的摩爾濃度不變，考察了菌體質(zhì)量濃度對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和對映體過剩值的影響，實驗結(jié)果如圖9所示.當(dāng)菌體質(zhì)量濃度不斷增加時，底物的轉(zhuǎn)化率隨之增大，菌體質(zhì)量濃度超過30 g/L時，轉(zhuǎn)化率不再改變.因此，最佳的菌體質(zhì)量濃度(菌體干重/反應(yīng)液體積)為30 g/L.在不同菌體質(zhì)量濃度下得到的產(chǎn)物(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的e.e.值均為100%.

圖9 不同菌體質(zhì)量濃度對反應(yīng)的影響Fig.9 Effect of cell concentration on reduction

2.2.7 不同底物濃度對反應(yīng)的影響

研究了不同濃度的3-羰基-3-苯基丙酸乙酯(0.024～0.075 mol/L)對還原轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物對映體過剩值的影響，實驗結(jié)果如圖10所示.當(dāng)?shù)孜锏臐舛扔?.024 mol/L增加到0.050 mol/L時，轉(zhuǎn)化率均能達(dá)到100%.當(dāng)濃度高于0.050 mol/L時，轉(zhuǎn)化率明顯降低，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.062，0.075 mol/L時，轉(zhuǎn)化率分別僅有65.3%，55.7%.這是由于底物的生物相容性差，同時高濃度的底物會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性.因此，最適宜的底物濃度為0.050 mol/L.

圖10 不同底物濃度對反應(yīng)的影響Fig.10 Effect of the substrate concentration on reduction

2.3 兩相體系與單一水相體系的比較

將2.2中得到的最優(yōu)反應(yīng)條件和單一水相的反應(yīng)條件進(jìn)行對比，以轉(zhuǎn)化率作為研究目標(biāo)比較兩相體系和單一水相體系的優(yōu)勢，實驗結(jié)果如圖11所示.磷酸鹽緩沖液/鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系中，底物質(zhì)量濃度可達(dá)到 9.6 g/L，轉(zhuǎn)化率能達(dá)到100%，而在單一水相中，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，轉(zhuǎn)化率卻隨之不斷降低，單一水相中最適底物質(zhì)量濃度為4.8 g/L，轉(zhuǎn)化率最高為82.7%.由圖11可知：磷酸鹽緩沖液/鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系作為反應(yīng)介質(zhì)能增加底物3-羰基-3-苯基丙酸乙酯的利用率，提高其轉(zhuǎn)化率.

圖11 兩相體系和單一水相中轉(zhuǎn)化率的比較Fig.11 Comparation of conversion in single aqueous phase and diphasic system

3 結(jié) 論

在磷酸鹽緩沖液/鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系中，熱帶假絲酵母CandidatropicalisCGMCC NO.15016不對稱還原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制備(R)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯的效果最佳.以1∶1的磷酸鹽緩沖液與有機(jī)溶劑的體積比，30 g/L的菌體質(zhì)量濃度(菌體干重/反應(yīng)液體積)，0.05 mol/L的底物濃度，8%添加量的乙醇作為輔助底物，磷酸鹽緩沖液pH=6，并在36 ℃，120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)48 h，轉(zhuǎn)化率及對映體過剩值均可達(dá)到100%.與單一水相相比，底物質(zhì)量濃度提高至9.6 g/L，轉(zhuǎn)化率提高了17.3%.這充分說明了磷酸鹽緩沖液/有機(jī)溶劑兩相體系可以解除單一水相體系中底物和產(chǎn)物的抑制作用，大大提高了反應(yīng)效率.