TRIM1、occludin、ZO-1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

紀(jì)偉平 盧明東 黃穎鵬 王娟 楊向群

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[1]。細(xì)胞極性紊亂或喪失是結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要病理改變[2]。在細(xì)胞極性喪失的腫瘤細(xì)胞惡變過程中，往往伴有細(xì)胞極性蛋白如occludin、ZO-1等表達(dá)下調(diào)[3]。三結(jié)構(gòu)域蛋白（TRIM）含有3個特征性結(jié)構(gòu)域，即1個鋅指結(jié)構(gòu)域、1或2個鋅離子結(jié)構(gòu)域和1個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，一般發(fā)揮E3泛素連接酶功能[4-6]，在天然免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架重塑、發(fā)育、細(xì)胞周期和凋亡、DNA損傷修復(fù)等生理過程中起著重要作用[7]。TRIM異常通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、DNA損傷修復(fù)和凋亡等信號通路在癌癥中發(fā)揮作用[8]，還通過調(diào)控NF-κB信號通路在炎癥向癌癥發(fā)展過程中發(fā)揮作用[9-10]。TRIM1是TRIM家族的重要一員，目前尚無關(guān)于TRIM1在結(jié)腸癌中表達(dá)及與occludin、ZO-1表達(dá)關(guān)系的相關(guān)報道。因此，本研究檢測TRIM1、occludin、ZO-1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，同時分析3者間的相關(guān)性以及與結(jié)腸癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2011年1月至2013年1月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的120例結(jié)腸癌患者手術(shù)切除的癌組織及其癌旁正常組織標(biāo)本為研究對象。其中男65例，女 55 例；年齡 14～80[61（54，67）]歲；參照 WHO 組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，確定病理類型均為腺癌非特殊型；分化程度：高分化16例，中分化71例，低分化33例；參照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）提出的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期30例，Ⅱ期32例，Ⅲ期58例；腫瘤浸潤深度：T1期24例，T2期37例，T3期50例，T4期9例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移93例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例；均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；術(shù)前均未接受過新輔助化療。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 遵循無菌原則取材，所取組織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，免疫組化染色采用S-P法檢測。標(biāo)本切片依次經(jīng)過脫蠟、水化、抗原修復(fù)（采用酸修復(fù)）、3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶等處理；采用免疫組化S-P法通用型染色試劑盒進(jìn)行染色；陽性部位呈棕褐色。所加一抗（兔抗人TRIM1和鼠抗人occludin、鼠抗人ZO-1單克隆抗體）均購自R&D公司，DAB顯色劑購自武漢博士德公司。

1.2.2 染色結(jié)果的判斷 由2位病理科醫(yī)師在顯微鏡下觀察，根據(jù)陽性染色范圍及程度進(jìn)行評分。采取陽性染色面積與染色強(qiáng)度的評分相乘方式，每個切片重復(fù)觀察5個高倍視野。陽性染色面積賦值：＜1%為0分，1%～30%為1分，＞30%～50%為2分，＞50%為3分；染色強(qiáng)度賦值：弱陽性為1分，陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分。將5個高倍視野的染色面積評分均值與染色強(qiáng)度評分均值相乘，即表達(dá)評分。表達(dá)評分＞4分為高表達(dá)，≤4分為低表達(dá)。

1.3 評估指標(biāo) 比較結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)水平，并分析結(jié)腸癌組織中TRIM1表達(dá)與occludin、ZO-1表達(dá)的相關(guān)性。收集結(jié)腸癌患者性別、年齡、腫瘤部位、臨床分期、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)的關(guān)系；同時分析TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用配對樣本t檢驗(yàn)；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。結(jié)腸癌組織中TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。采用Kaplan-Meier法繪制結(jié)腸癌組織中TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)高、低者的生存曲線，并進(jìn)行l(wèi)ogrank檢驗(yàn)。采用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年總生存的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及其癌旁正常組織中TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)評分比較 結(jié)腸癌組織中TRIM1表達(dá)評分為（4.37±1.83）分，明顯高于癌旁正常組織的（3.72±1.98）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.64，P＜0.05）；結(jié)腸癌組織中occludin表達(dá)評分為（3.09±1.71）分，明顯低于癌旁正常組織的（3.53±1.65）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.03，P＜0.05）；結(jié)腸癌組織中ZO-1表達(dá)評分為（3.22±2.07）分，明顯低于癌旁正常組織的（3.75±1.23）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.41，P＜0.05），見圖 1。

圖1 TRIM1、occludin、ZO-1在結(jié)腸癌組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)（免疫組化染色，×200）

2.2 結(jié)腸癌組織中TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)腸癌組織中TRIM1表達(dá)與occludin、ZO-1表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.420、-0.343，均 P＜0.05），見表 1。

表1 結(jié)腸癌組織中TRIM1、occludin、ZO-1高低表達(dá)的交叉表（例）

2.3 結(jié)腸癌組織中TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 結(jié)腸癌組織中TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)與腫瘤臨床分期、分化程度、T分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)（均P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤部位等均無關(guān)（均P ＞0.05），見表2。

表2 結(jié)腸癌組織中TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[例（%）]

2.4 結(jié)腸癌組織中TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 120例結(jié)腸癌患者均獲得術(shù)后5年完整的隨訪信息。經(jīng)生存分析，TRIM1高、低表達(dá)者平均生存時間分別為（45.06±50.55）、（56.24±59.47）個月；TRIM1 高表達(dá)者5年累積生存率為35.2%，明顯低于TRIM1低表達(dá)者的 85.7%（χ2=29.31，P＜0.05），見圖 2a（插頁）。occludin高、低表達(dá)者平均生存時間分別為（54.54±59.16）、（46.90±51.98）個月；occludin 高表達(dá)者 5 年累積生存率為 82.5%，明顯高于occludin低表達(dá)者的42.5%（χ2=15.66，P＜0.05），見圖2b（插頁）。ZO-1高、低表達(dá)者平均生存時間分別為（54.13±59.69）、（47.55±52.32）個月；ZO-1高表達(dá)者5年累積生存率為82.4%，明顯高于ZO-1低表達(dá)者的45.3%（χ2=12.38，P＜0.05），見圖 2c（插頁）。經(jīng)Cox比例風(fēng)險回歸模型分析，TRIM1高表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者術(shù)后5年總生存的獨(dú)立危險因素（HR=2.374，95%CI：1.04～5.44，P＜0.05）。

3 討論

隨著對腫瘤認(rèn)識的不斷加深，學(xué)者對腫瘤相關(guān)因子的研究逐漸從單一分子向家族分子或序貫式關(guān)聯(lián)分子群轉(zhuǎn)變。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，并非由單一分子發(fā)揮作用，大部分是由眾多分子相互作用進(jìn)而傳遞分子信號，從而產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞或生物行為。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中TRIM1表達(dá)明顯升高，occludin、ZO-1表達(dá)明顯降低；TRIM1表達(dá)與occludin、ZO-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)TRIM1、occludin、ZO-1蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期、分化程度、T分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)；TRIM1高表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者術(shù)后5年總生存的獨(dú)立危險因素。

細(xì)胞極性是正常細(xì)胞功能建立與維持的關(guān)鍵，它是細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞中某些胞質(zhì)成分、細(xì)胞表面信號分子、細(xì)胞器及細(xì)胞骨架等生理組織結(jié)構(gòu)按一定空間順序不均等分布以及細(xì)胞行使功能的不對稱性[11-16]。緊密連接作為一個封閉的屏障，具有保持細(xì)胞極性及穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞通透性的作用，是上皮細(xì)胞極性建立與維持的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)[17]。一般認(rèn)為，上皮細(xì)胞緊密連接的形成意味著細(xì)胞極性的建立[18-19]。此外，緊密連接不僅調(diào)控上皮細(xì)胞層內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)、小分子和離子的平衡，還調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及分化，抑制腫瘤細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，它是細(xì)胞內(nèi)外眾多極性調(diào)控信號進(jìn)行整合的重要平臺。上皮細(xì)胞極性的喪失是上皮細(xì)胞起源癌癥的一個重要特征[2]。細(xì)胞極性蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常及蛋白功能的紊亂，或者由此形成的細(xì)胞極性微環(huán)境改變等，在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。occludin、ZO-1是極性建立過程中發(fā)揮主要作用的極性蛋白，在多種惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)，并與其惡性進(jìn)展密切相關(guān)[3]。

TRIM1是TRIM家族的重要分子蛋白，在天然免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架重塑、發(fā)育、細(xì)胞周期和凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用。目前關(guān)于該家族分子在惡性腫瘤尤其是結(jié)腸癌中的生物學(xué)作用缺乏系統(tǒng)的研究。本文就TRIM1、occludin、ZO-1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義進(jìn)行探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中TRIM1表達(dá)升高，occludin、ZO-1表達(dá)降低；TRIM1表達(dá)與occludin、ZO-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。TRIM1、occludin、ZO-1表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床分期、分化程度、T分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，TRIM1高表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者術(shù)后5年總生存的獨(dú)立危險因素。關(guān)于TRIM1在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的調(diào)控作用及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。