27-羥基膽甾醇誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制

朱夢嬌 黃燕燕 曹立 唐維國

27-羥基膽甾醇（27-OHCH）是一種典型的膽固醇氧化代謝產(chǎn)物，能自由通過血腦屏障而進(jìn)入腦內(nèi)，從而影響腦中髓鞘形成及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[1-2]。痙攣性截癱5型（SPG5A）的致病基因膽固醇7α羥化酶（CYP7B1）基因發(fā)生突變[3]，會(huì)引起神經(jīng)中樞神經(jīng)甾體代謝和肝內(nèi)膽固醇旁路代謝異常，主要表現(xiàn)在肝臟對27-OHCH、在神經(jīng)中樞對脫氫表雄酮（DHEA）進(jìn)行羥化反應(yīng)異常[4]。Schüle等[5]發(fā)現(xiàn)SPG5A患者血清中27-OHCH濃度是對照組的6～7倍，攜帶者與正常對照者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SPG5A患者腦脊液中27-OHCH濃度是對照組的30～50倍，但腦脊液中氧化型膽固醇等指標(biāo)均正常。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，CYP7B1基因敲除的3月齡小鼠腦脊液中27-OHCH濃度明顯高于野生型小鼠[6]。SPG5A患者和CYP7B1基因敲除小鼠腦脊液中27-OHCH濃度明顯升高，提示27-OHCH濃度升高可能是SPG5A發(fā)病的重要因素。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號(hào)通路是參與細(xì)胞生長、增殖及死亡調(diào)控的重要通路之一[7]。中度或不持續(xù)的AKT活化能抑制細(xì)胞凋亡，通過各種下游效應(yīng)分子促進(jìn)細(xì)胞生長和血管生成；相反，AKT的過度激活會(huì)引發(fā)細(xì)胞衰老和凋亡[8]。27-OHCH能促使神經(jīng)細(xì)胞生成β-淀粉樣蛋白明顯增多[9-10]，上調(diào)Caspase-12，從而影響線粒體膜電位，使得活性氧自由基（ROS）蓄積，引起細(xì)胞凋亡[11-13]；但具體調(diào)控機(jī)制目前尚未闡明。本研究將AKT抑制劑LY294002作用于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y），封閉PI3K/AKT信號(hào)通路，觀察27-OHCH的細(xì)胞毒效應(yīng)是否受其影響，進(jìn)而探索27-OHCH誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為進(jìn)一步揭示SPG5A的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵育箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑及儀器 27-OHCH（英國Tocris Bioscience公司），以無水乙醇作為溶劑配置成20mM母液，置-20℃保存?zhèn)溆?；RPMI 1640培養(yǎng)基、含 FBS的 DMSO、ACCUTASETM細(xì)胞消化液（美國Gibco公司）；抑制劑LY294002、DAPI染液、CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；0.45μm硝酸纖維素膜（美國Millipore公司）；Annexin V-PE/7-AAD試劑盒（美國BD Sciences公司）；AKT、磷酸化 AKT（p-AKT）、Caspase-9、β-actin 等抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 取5×104個(gè)/ml對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)置不同濃度（3.125、6.25、12.5、25.0、50.0μM）27-OHCH 處理組、溶劑對照組（添加與27-OHCH處理組相應(yīng)濃度的無水乙醇）、空白組（孔內(nèi)不加細(xì)胞，僅加細(xì)胞培養(yǎng)液）、陰性對照組（孔內(nèi)加細(xì)胞，但不添加27-OHCH），每組6個(gè)復(fù)孔，分別作用24、48h后，吸去舊培養(yǎng)基；將培養(yǎng)基與CCK-8試劑按10∶1混勻，每孔加入100μl混合試劑；將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育2h；利用酶標(biāo)儀于450nm處測定吸光度（A）值。利用公式計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=[（A27-OHCH處理組-A空白組）/（A溶劑對照組-A空白組）]×100%。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 取1×105個(gè)/ml對數(shù)生長期細(xì)胞接種于φ14mm細(xì)胞爬片，次日加入不同藥物濃度的27-OHCH。設(shè)置不同濃度的27-OHCH處理組，AKT通路抑制劑組（10μM LY294002提前作用2h，再加入不同濃度的27-OHCH）、陰性對照組，其中27-OHCH的濃度為 12.5、25.0μM；作用 48h 后，甲醛固定 10min，DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.5 Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi) p-AKT、cleaved-caspase-9蛋白表達(dá) 取1×105/ml對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板，設(shè)置27-OHCH處理組、AKT通路抑制組（10μM LY294002提前作用2h，再加入不同濃度的27-OHCH）、空白對照組，其中27-OHCH的濃度為0、3.125、6.25、12.5、25.0、50.0μM。作用 48h 后用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，取蛋白樣品約15μl，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜于0.45μm硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃過夜；TBST緩沖液洗膜3次，10min/次；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育1h；TBST緩沖液洗膜3次，10min/次；將膜置于ECL化學(xué)發(fā)光劑中，用X線膠片曝光、顯影及定影；以β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用Quantity one軟件計(jì)算各WB條帶的灰度值。

1.6 Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 取1×105個(gè)/ml對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板，設(shè)置不同濃度的27-OHCH處理組、AKT通路抑制組（10μM LY294002提前作用2h，再加入不同濃度的27-OHCH）、無水乙醇溶劑對照組、無水乙醇+DMSO溶劑對照組，其中27-OHCH的濃度為12.5、25.0μM。利用ACCUTASETM細(xì)胞消化液消化細(xì)胞；800r/5min離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于100μl結(jié)合液中；加入5μl Annexin V-PE和5μl 7-AAD，避光、室溫孵育15min；FACS Calibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，應(yīng)用FlowJo軟件分析細(xì)胞凋亡率。Annexin V-/7-AAD-為活細(xì)胞，Annexin V+/7-AAD-為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V+/7-AAD+為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞；其中Annexin V+/7-AAD-、Annexin V+/7-AAD+為凋亡細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 27-OHCH對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 給藥24h，12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH 處理組 SH-SY5Y 細(xì)胞存活率均較陰性對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）；給藥 48h，不同濃度（3.125～50.0μM）27-OHCH處理組SH-SY5Y細(xì)胞存活率均較陰性對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。提示隨著27-OHCH濃度增加或給藥時(shí)間延長，SH-SY5Y細(xì)胞存活率均明顯下降，見圖1。

圖1 27-OHCH對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響（與陰性對照組比較，*P＜0.05）

2.2 AKT抑制劑逆轉(zhuǎn)27-OHCH細(xì)胞毒效應(yīng)的形態(tài)學(xué)觀察 在光學(xué)顯微鏡下，12.5、25.0μM 27-OHCH處理組作用48h后，SH-SY5Y細(xì)胞數(shù)量較陰性對照組明顯減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化（細(xì)胞皺縮變圓，貼壁能力減弱），隨著27-OHCH濃度增加，變化越明顯。DAPI染色結(jié)果顯示，12.5、25.0μM 27-OHCH處理組SH-SY5Y細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象（核內(nèi)染色質(zhì)不規(guī)則凝集，細(xì)胞核破碎成塊狀或半月狀，凋亡小體出現(xiàn)），隨著27-OHCH濃度增加，凋亡現(xiàn)象越明顯。與相同濃度的27-OHCH處理組比較，在光學(xué)顯微鏡下AKT通路抑制組SH-SY5Y細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞形態(tài)較好；在熒光顯微鏡下細(xì)胞核凋亡現(xiàn)象有所減弱，見圖2。

圖2 AKT抑制劑逆轉(zhuǎn)27-OHCH細(xì)胞毒效應(yīng)的形態(tài)學(xué)觀察[a：陰性對照組；b：27-OHCH（12.5μM）處理組；c：27-OHCH（25.0μM）處理組；d：LY294002（10μM）+27-OHCH（12.5μM）組；e：LY294002（10μM）+27-OHCH（25.0μM）組]

2.3 27-OHCH對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)p-AKT、cleavedcaspase-9蛋白表達(dá)的影響 隨著27-OHCH處理組濃度的增加，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)p-AKT（Ser 473）表達(dá)逐漸增強(qiáng)，見圖 3a；經(jīng)定量分析，12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH處理組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)p-AKT（Ser 473）表達(dá)水平較陰性對照組均明顯升高（均P＜0.05），見圖4。12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH 處理組 SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)cleaved-caspase-9（37/35kD）表達(dá)明顯增強(qiáng)，見圖 3b。經(jīng)AKT抑制劑預(yù)作用后，不同濃度（0～50.0μM）27-OHCH處理組p-AKT（Ser 473）表達(dá)均受抑制，見圖3c；而12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH 處理組 cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)變化不明顯，見圖3d。提示27-OHCH能引起SHSY5Y細(xì)胞凋亡，AKT通路可能在其中發(fā)揮作用。

圖3 27-OHCH對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)p-AKT、cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)的電泳圖

圖4 不同濃度27-OHCH處理組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)p-AKT（Ser 473）表達(dá)水平（與陰性對照組比較，*P＜0.05）

2.4 AKT抑制劑逆轉(zhuǎn)27-OHCH細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的作用給藥48h，12.5、25.0μM 27-OHCH處理組均能引起SHSY5Y細(xì)胞凋亡效應(yīng)，細(xì)胞凋亡率分別為（24.04±0.83）%和（42.95±3.89）%，均高于無水乙醇溶劑對照組的（9.44±0.32）%（均 P＜0.05）。AKT 抑制劑預(yù)作用 2h能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡效應(yīng)，LY294002（10μM）+27-OHCH（12.5μM）組細(xì)胞凋亡率為（16.03±0.39）%，明顯低于 12.5μM 27-OHCH 處理組（P＜0.05）；LY294002（10μM）+27-OHCH（25.0μM）組細(xì)胞凋亡率為（22.77±1.83）%，明顯高于無水乙醇+DMSO 溶劑對照組的（11.05±0.61）%（P＜0.05），但明顯低于 25.0μM 27-OHCH 處理組（P＜0.05），見圖5。提示AKT抑制劑能逆轉(zhuǎn)27-OHCH對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

圖5 Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況

3 討論

27-OHCH是外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇側(cè)鏈被氧化的主要羥固醇產(chǎn)物之一，可通過血腦屏障入腦。研究發(fā)現(xiàn)SPG5A患者腦脊液中的27-OHCH濃度明顯升高，經(jīng)無膽固醇飲食或長期鵝去氧膽治療，可能降低神經(jīng)甾體的濃度，從而改善或穩(wěn)定SPG5A患者癥狀[5，14]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默?。ˋD）患者大腦27-OHCH濃度較正常對照組急劇升高[15]。血漿膽固醇水平升高能使羥固醇入腦增多，影響神經(jīng)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及功能，進(jìn)而引起β-淀粉樣蛋白增多，進(jìn)一步影響AD的發(fā)生、發(fā)展[16-17]?？梢姡?7-OHCH濃度異常與中樞系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病可能有關(guān)[3-4]。Prasanthi等[10]發(fā)現(xiàn)27-OHCH作用于SH-SY5Y細(xì)胞后，該細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)，與AD發(fā)病機(jī)制相關(guān)蛋白如β-淀粉樣蛋白、磷酸化Tau蛋白水平亦明顯升高。此外，研究表明27-OHCH作用于SH-SY5Y細(xì)胞后，α-突觸核蛋白水平明顯升高，從而引起ROS蓄積、炎癥損傷、細(xì)胞凋亡[11-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，27-OHCH能誘導(dǎo) SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡，給藥 24h，12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH處理組細(xì)胞存活率均明顯降低；給藥48h，各藥物濃度均可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞存活率降低。熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，12.5、25.0μM 27-OHCH處理組能誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞數(shù)量減少。目前尚無研究涉及27-OHCH的調(diào)控機(jī)制，因此，筆者就27-OHCH誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞毒效應(yīng)的信號(hào)通路作一研究。

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞生存的重要信號(hào)通路之一，它在細(xì)胞增殖、分化及死亡等方面起著重要作用。AKT是PI3K下游的效應(yīng)分子，PI3K結(jié)合AKT的PH結(jié)構(gòu)域能使AKT從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，并改變其構(gòu)象，使得AKT Thr 308或Ser 473位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從抑制狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)[12]。中度或不持續(xù)的AKT活化能抑制細(xì)胞凋亡，通過各種下游效應(yīng)分子促進(jìn)細(xì)胞生長和血管生成[18-19]。然而，AKT的過度激活會(huì)引發(fā)細(xì)胞衰老和凋亡，主要機(jī)制是通過增加胞內(nèi)ROS產(chǎn)量，抑制FoxO轉(zhuǎn)錄因子并下調(diào)其下游抗氧化酶MnSOD、過氧化氫酶等表達(dá)[8]。Nogueira等[20]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞AKT的活化程度越高，對ROS誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)越靈敏。更有以此為基礎(chǔ)，通過雷帕霉素過度激活癌細(xì)胞AKT活化水平，達(dá)到消除腫瘤細(xì)胞的目的[21]。本研究發(fā)現(xiàn)濃度遞增的27-OHCH（3.125～50.0μM）作用于 SH-SY5Y 細(xì)胞，隨著細(xì)胞內(nèi)AKT活化水平的增加，細(xì)胞凋亡程度明顯增強(qiáng)，推測27-OHCH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)與AKT過度活化相關(guān)。此外，顯微鏡下觀察、Western blot和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果均表明AKT通路抑制劑LY294002能逆轉(zhuǎn)27-OHCH誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。

綜上所述，27-OHCH通過PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)。本研究對該調(diào)控通路的探討，為最終揭開27-OHCH相關(guān)神經(jīng)退行性疾病病因、尋找有效的臨床治療方法及靶點(diǎn)提供了新方向。