茶藨子屬ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和比較分析

劉 虹，薛 青，黃 文，覃 瑞

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

茶藨子屬(RibesL.)隸屬于虎耳草科，全球約160種，主要分布于北半球溫帶和較寒冷地區(qū)，少數(shù)種類延伸到亞熱帶和熱帶山地. 我國(guó)產(chǎn)59種30變種，隸屬于4亞屬10組15系，主產(chǎn)西南部、西北部及東北部[1]. 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)茶藨子屬分類、代謝物等研究較多，但在分類上仍以經(jīng)典的形態(tài)學(xué)分類為主[2]，雖然對(duì)茶藨子屬植物的化學(xué)分類、花粉和葉片形態(tài)和種子蛋白血清學(xué)等進(jìn)行了一定研究，但對(duì)該屬的分類位置尚未取得一致的結(jié)論[3，4]. 茶藨子屬與虎耳草科的其他屬之間呈現(xiàn)出形態(tài)上的連續(xù)性和間斷性，表明它們有較近的親緣關(guān)系，伴隨本屬一些新種不斷的發(fā)現(xiàn)[5]，一些學(xué)者認(rèn)為茶藨子屬應(yīng)獨(dú)立成科. 由于茶藨子屬植物形態(tài)變異幅度較大，僅根據(jù)形態(tài)學(xué)難以進(jìn)行準(zhǔn)確分類，有必要采用分子生物學(xué)的手段對(duì)茶藨子屬植物的系統(tǒng)發(fā)育及物種間的親緣關(guān)系進(jìn)行分析.

目前，物種的分類研究已經(jīng)從過(guò)去的形態(tài)學(xué)分類轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿酉到y(tǒng)學(xué)及代謝組學(xué)研究[6-7]，這種轉(zhuǎn)變使物種進(jìn)化關(guān)系的研究取得了突破性進(jìn)展. 與形態(tài)學(xué)特征相比，DNA反映的是物種的遺傳本質(zhì)，受環(huán)境影響小，能夠較好地解析種內(nèi)和種間的差異. 另一方面，由于DNA的進(jìn)化速率存在差異，所以不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育研究會(huì)選擇不同來(lái)源的DNA[8]. 由于核基因組中的非編碼序列的進(jìn)化速率比編碼序列的進(jìn)化速率更快，其中的ITS序列常用來(lái)研究種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，ITS序列在被子植物中的長(zhǎng)度一般小于700 bp，對(duì)ITS序列的分析已成為在分子水平上探討植物高階元系統(tǒng)發(fā)育的重要手段[9-10]. ITS區(qū)域由ITS1、ITS2和5.8 Sr DNA 3部分構(gòu)成，其中5.8 Sr DNA高度保守，基本無(wú)變異，ITS1和ITS2都屬于中度保守序列，進(jìn)化速率快且片段較小，常用來(lái)區(qū)分不同的物種和鑒定物種間的親緣關(guān)系. ITS2序列(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2，Internal Transcribed Spacer 2)介于5.8 S和26 S之間，屬于中度保守序列，序列長(zhǎng)度較短且進(jìn)化速度較快，適于科以下的低分類階元如屬內(nèi)及種間的系統(tǒng)學(xué)研究[11-13]. 基于上述因素，本研究采用生物信息學(xué)的方法對(duì)茶藨子屬的ITS2序列進(jìn)行了一系列分析，以期為中國(guó)茶藨子屬植物的分子系統(tǒng)發(fā)育及種間親緣關(guān)系分析提供初步的科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

本研究共涉及茶藨子屬(Ribes)30個(gè)物種的ITS2序列，所有序列均從Genbank獲得，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)源詳見(jiàn)表1，外源對(duì)比物種選用桔?？艭ampanulaceae黨參屬的羊乳Codonopsislanceolata(Sieb. et Zucc.) Trautv. 因其與所選擇的茶藨子的ITS2序列的相似度最高，所以本文選取羊乳作為分支分析的外類群.

1.2 研究方法

從Genbank上下載ITS2序列經(jīng)人工校對(duì)后，用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò)MEGA7.0軟件計(jì)算遺傳距離(K2P)，比較30個(gè)物種序列間的差異性，并以羊乳的ITS2序列為外類群進(jìn)行比較，bootstrap proportions(BP)參數(shù)值設(shè)為重復(fù)1000次，構(gòu)建鄰接(NJ)聚類樹(shù). 所有序列用RNA Structure5.4軟件預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果與分析

2.1 茶藨子屬ITS2序列特征

茶藨子屬30個(gè)物種的ITS2序列長(zhǎng)度為222～240 bp，堿基鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶(GC)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為57.14%～59.24%(表1)，不同物種間的變異位點(diǎn)為27個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)為13個(gè). 30個(gè)物種的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的A、B、C、D臂的突環(huán)、內(nèi)環(huán)和發(fā)卡環(huán)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2. ITS2序列在種間變異較大，種間遺傳變異(遺傳距離為0.004～0.039)大于種內(nèi)遺傳變異(表3).

表1 所選茶藨子屬植物名稱及GenBank號(hào)Tab.1 The origin and GenBank number of Ribes spp.

表2 茶藨子屬30個(gè)種A、B、C、D臂的突環(huán)、內(nèi)環(huán)和發(fā)卡環(huán)部分?jǐn)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab. 2 Partial data statistics of hairpin, bulge, internal loop of arm A, B, C and D of 30 species in Ribes

表3 茶藨子屬ITS2序列的K2P遺傳距離Tab. 3 K2P genetic distance of the ITS2 sequence in genus Ribes

茶藨子屬的二級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，與大多數(shù)真核生物ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，茶藨子屬的二級(jí)結(jié)構(gòu)類似三葉草狀，以一個(gè)大的多分枝環(huán)為中心，四周延長(zhǎng)出至少4個(gè)臂，其基序?yàn)閁-U mismatch和U-U mismatch with AAA和UGGU(圖1，2). 編號(hào)從5′端開(kāi)始，在3'端結(jié)束. 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在莖環(huán)的位置、數(shù)目、大小及螺旋發(fā)出時(shí)的角度不同. 預(yù)測(cè)的茶藨子屬的二級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可分為α型和β型兩種結(jié)構(gòu)，區(qū)別在于：α型在A臂中含有4個(gè)突環(huán)，2個(gè)內(nèi)環(huán)和1個(gè)發(fā)夾環(huán)，發(fā)夾環(huán)的堿基為TCTACGG，而β型在A臂中含有5個(gè)突環(huán)，1個(gè)內(nèi)環(huán)和1個(gè)發(fā)夾環(huán)，發(fā)夾環(huán)的堿基為TCTAGCG. α型和β型兩種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的其他臂結(jié)構(gòu)類似，其中B臂都含有2個(gè)突環(huán)和1個(gè)發(fā)夾環(huán)，C臂的臂長(zhǎng)最長(zhǎng)且結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，含有9個(gè)突環(huán)，2個(gè)內(nèi)環(huán)和1個(gè)發(fā)夾環(huán)，D臂的臂長(zhǎng)最短，結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，含有1個(gè)突環(huán)和1個(gè)發(fā)夾環(huán)，均具有屬的特異性. 從圖1～2可以看出茶藨子屬30個(gè)種的結(jié)構(gòu)類型趨向一致，變化性特征性較少.

圖1 茶藨子屬的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的α型Fig.1 α - type of ITS2 secondary structure of genus Ribes

圖2 茶藨子屬的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的β型Fig.2 β - type of ITS2 secondary structure of genus Ribes

2.2 茶藨子屬的系統(tǒng)發(fā)育分析

茶藨子屬30個(gè)物種的平均遺傳距離為0 < d = 0.017 < 1，可構(gòu)建鄰接聚類樹(shù). 以羊乳為外類群構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示，結(jié)果顯示30個(gè)種都聚成1大枝11小枝，與陸玲娣等[2-6]依據(jù)形態(tài)學(xué)對(duì)茶藨子屬的分類結(jié)果基本一致.

圖3 茶藨子屬基于ITS2序列構(gòu)建的鄰接聚類樹(shù)Fig.3 Adjacent clustering tree constructed based on ITS2 sequence

3 討論

茶藨子屬植物主要通過(guò)形態(tài)特征等對(duì)其進(jìn)行劃分，各國(guó)學(xué)者對(duì)該屬的分類位置和屬下類群的劃分均有爭(zhēng)議[2,5,6]. 本研究通過(guò)對(duì)茶藨子屬的ITS2序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，進(jìn)一步驗(yàn)證了前人對(duì)茶藨子屬的經(jīng)典分類學(xué)研究結(jié)果.

在植物的基因組中，不同的基因具有不同的進(jìn)化速率，進(jìn)化速率較快的基因可用來(lái)解決物種間的關(guān)系問(wèn)題，ITS序列具有高度的變異性又有相對(duì)保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，適用于在較低的分類階元上解決植物的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題[9,12,13]. 植物系統(tǒng)在長(zhǎng)期的演化過(guò)程中，不僅在一級(jí)結(jié)構(gòu)水平上保留進(jìn)化痕跡，在二級(jí)結(jié)構(gòu)水平上也同樣如此，高級(jí)結(jié)構(gòu)與其功能之間的聯(lián)系更為密切，在這一層面上的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)于一級(jí)結(jié)構(gòu)可以更直觀地揭示物種進(jìn)化史[8,9,10]. 王毅等[8]對(duì)紫菀族的32個(gè)物種的ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明了ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)紫菀族各種的鑒定及親緣關(guān)系研究的可行性. 吳亞男等[14]通過(guò)對(duì)茄科酸漿屬ITS序列聚類分析表明該法能有效地區(qū)分物種種內(nèi)關(guān)系. 李倩等[15]通過(guò)對(duì)絨泡菌目黏菌的ITS1和ITS2的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)雖然在不同物種形成螺旋的位置和數(shù)目不同，但是它們都仍具有一些保守的螺旋結(jié)構(gòu).

為了鑒定并對(duì)茶藨子屬進(jìn)行分類，本研究不僅利用ITS2的一級(jí)序列的分歧分析了其序列的堿基GC含量、計(jì)算變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)等，也使用了ITS2二級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的信息來(lái)進(jìn)行研究. 以分子形態(tài)特征對(duì)茶藨子屬建立系統(tǒng)發(fā)育的鑒定，通過(guò)對(duì)茶藨子屬30個(gè)種進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，確定了ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)均有類似的結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)統(tǒng)計(jì)內(nèi)環(huán)、突環(huán)數(shù)量以及發(fā)卡環(huán)堿基數(shù)可知(表2)，A臂結(jié)構(gòu)變異較大可分為α型和β型兩種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中α型(圖1)在A臂中含有4個(gè)突環(huán)，2個(gè)內(nèi)環(huán)和1個(gè)發(fā)夾環(huán)，而β型(圖2)，在A臂中含有5個(gè)突環(huán)，1個(gè)內(nèi)環(huán)和1個(gè)發(fā)夾環(huán).兩種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的其他臂結(jié)構(gòu)類似，且莖環(huán)的大小、位置和堿基類型都呈現(xiàn)出高度保守的特點(diǎn)，說(shuō)明在二級(jí)結(jié)構(gòu)上也具有遺傳信息的保守性，這為茶藨子屬的分類提供了參考價(jià)值. 研究發(fā)現(xiàn)ITS2的一級(jí)結(jié)構(gòu)突變豐富，但是在二級(jí)結(jié)構(gòu)上的一些區(qū)域較保守(如ITS2中B臂、C臂、D臂區(qū))，大部分的點(diǎn)突變并未造成這些區(qū)域上臂環(huán)構(gòu)型的改變，可以推測(cè)這些臂環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)ITS行使其加工功能有關(guān)鍵的作用，這些臂環(huán)結(jié)構(gòu)主要由G-C、G-T、A-T鍵構(gòu)成，GC含量較高，A-U鍵較少，這些穩(wěn)定的臂環(huán)結(jié)構(gòu)可能行使類似于tRNA中反密碼子的功能，通過(guò)結(jié)合特定的反式作用因子對(duì)前體rRNA進(jìn)行加工. 這些類似的UGGU、UAAA保守區(qū)域是否作為識(shí)別位點(diǎn)存在，ITS區(qū)域二級(jí)結(jié)構(gòu)能否通過(guò)臂區(qū)堿基高度匹配，將這些識(shí)別位點(diǎn)通過(guò)環(huán)的形式突出于空間結(jié)構(gòu)，使得剪接體能夠更高效地識(shí)別，提高整個(gè)核糖體40S前體RNA的剪接效率？這種現(xiàn)象是否真實(shí)存在，有待進(jìn)一步驗(yàn)證.

研究以K2P模型構(gòu)建ITS2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示構(gòu)建的聚類樹(shù)中，Ribesalpestre與簡(jiǎn)羊乳的ITS2序列在一支，而與屬內(nèi)其他種聚在不同枝，可能是環(huán)境等因素引起了個(gè)別堿基發(fā)生變異，從而聚為不同枝. 結(jié)合以前通過(guò)植物形態(tài)構(gòu)建的聚類樹(shù)，證實(shí)了ITS2序列及其二級(jí)結(jié)構(gòu)分析對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建及親緣關(guān)系的判定作用.這表明，采用ITS序列能夠滿足茶藨子屬大多數(shù)種類的鑒定，為茶藨子屬的系統(tǒng)分類提供了新的科學(xué)依據(jù).