不同無機(jī)鹽濃度對金霉素發(fā)酵生產(chǎn)影響

婁百勇 宋祺 曹華偉 楊永 宋偉

摘 要：目的：通過對金霉素發(fā)酵配方中各無機(jī)鹽配比進(jìn)行優(yōu)化，篩選最有利于金霉素生產(chǎn)的濃度比例提高金霉素發(fā)酵效能。方法：通過利用部分因子設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)出不同組合的無機(jī)鹽配方進(jìn)行初篩試驗(yàn)篩選對金霉素發(fā)酵效能有促進(jìn)作用的幾個(gè)無機(jī)鹽配比組合，綜合考慮無機(jī)鹽組分和其它成分的影響，采用響應(yīng)曲面優(yōu)化方法進(jìn)一步優(yōu)化金霉素發(fā)酵無機(jī)鹽配方。結(jié)果：優(yōu)化后金霉素發(fā)酵基礎(chǔ)配方中無機(jī)鹽配比為氯化鈉0.23%，硫酸銨0.63%，碳酸鈣0.57%，硫酸鎂0.025%，磷酸二氫鉀0%，且單批金霉素發(fā)酵效價(jià)及正放產(chǎn)量較初始配方條件分別提高852μ/ml和261kg，實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)增效的目的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同硫酸銨濃度對菌絲形態(tài)有一定影響。結(jié)論：不同無機(jī)鹽濃度對金霉素發(fā)酵有一定影響，經(jīng)優(yōu)化后金霉素發(fā)酵效能得到進(jìn)一步提高。

關(guān)鍵詞：無機(jī)鹽濃度；金霉素；發(fā)酵；效價(jià)；正放產(chǎn)量

中圖分類號(hào)：TQ927 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2018）27-0043-04

Abstract： Objective： to optimize the proportion of inorganic salts in chlortetracycline fermentation formula， and to select the best concentration ratio for chlortetracycline production to improve the efficiency of chlortetracycline fermentation. Methods： different combinations of inorganic salts were designed by using partial factor design method to screen out several combinations of inorganic salts which could promote the fermentation efficiency of chlortetracycline. Considering the effects of inorganic components and other components， response surface methodology was used to further optimize the formula of chlortetracycline fermentation inorganic salts. Results： the optimized basic formula of chlortetracycline fermentation was composed of sodium chloride 0.23%， ammonium sulfate 0.63%， calcium carbonate 0.57%， magnesium sulfate 0.025%， potassium dihydrogen phosphate 0%. 852 μ/ml and 261 kg. At the same time， it was found that different concentration of ammonium sulfate had some effect on the morphology of mycelium. Conclusion： different concentrations of inorganic salts have some effects on the fermentation of chlortetracycline， and the fermentation efficiency of chlortetracycline can be further improved after optimization.

Keywords： inorganic salt concentration； chlortetracycline； fermentation； potency； positive release yield

金霉素（Chlortetracycline），四環(huán)素類的一種廣譜抗生素，在醫(yī)療、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)上有廣泛的用途。在畜牧業(yè)上是用于飼料藥物添加劑的八大抗生素產(chǎn)品之一，金霉素以其抑菌、促生長、飼料利用率高，在機(jī)體內(nèi)殘留量低等特點(diǎn)，成為目前及今后較長時(shí)間內(nèi)在飼料工業(yè)中用量最大的抑菌促生長劑。

金霉素的生物合成是一項(xiàng)十分復(fù)雜的過程，影響其合成的因素也很多，如種子質(zhì)量、原料配方、工藝條件以及發(fā)酵過程的代謝調(diào)控等。我國從上世紀(jì)50年代開始生產(chǎn)金霉素， 過半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，目前國內(nèi)生產(chǎn)廠家以CaCO3，MgSO4，NaCl，（NH4）2SO4，CaCl2，KH2PO4作為主要發(fā)酵基礎(chǔ)無機(jī)鹽原料，發(fā)酵周期100小時(shí)左右，效價(jià)可達(dá)到20000-25000u/mL。[1]

無機(jī)鹽是微生物生長和代謝不可或缺的重要營養(yǎng)成分，對微生物生長代謝有重要影響，是很多代謝途徑所需要的酶激活劑。來源于農(nóng)作物原料的復(fù)合培養(yǎng)基中無機(jī)鹽種類豐富，但其含量可能不能滿足微生物快速生長和代謝的要求，勢必影響發(fā)酵產(chǎn)量。在培養(yǎng)基成分設(shè)計(jì)和優(yōu)化過程中，由于無機(jī)鹽的作用不如其它營養(yǎng)成分突出，加之基質(zhì)中存在的本底含量，常是被忽略的對象。因此，基于無機(jī)鹽添加，優(yōu)化金霉素發(fā)酵生產(chǎn)的復(fù)合培養(yǎng)基配方，對研究金霉素發(fā)酵高產(chǎn)條件有重要意義。[2]目前，關(guān)于金霉素合成的研究多是從工藝條件或代謝調(diào)控方面，有研究培養(yǎng)基也主要是從主要碳源玉米淀粉等著手，還沒有專門針對發(fā)酵培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度配方方面的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過利用部分因子設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)出不同組合的無機(jī)鹽配方進(jìn)行初篩試驗(yàn)篩選對金霉素發(fā)酵效能有促進(jìn)作用的幾個(gè)無機(jī)鹽配比組合，綜合考慮無機(jī)鹽組分和其它成分的影響，采用響應(yīng)曲面優(yōu)化方法進(jìn)一步優(yōu)化得到金霉素發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基無機(jī)鹽配方： 氯化鈉0.23%，硫酸銨0.63%，碳酸鈣0.57%，硫酸鎂0.025%，磷酸二氫鉀0%。無機(jī)鹽優(yōu)化后單批金霉素發(fā)酵效價(jià)及正放產(chǎn)量較初始配方條件分別提高852μ/ml和261kg，實(shí)現(xiàn)金霉素發(fā)酵生產(chǎn)增產(chǎn)增效的目的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同硫酸銨濃度對金霉素菌絲形態(tài)有一定影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

金色鏈霉菌（Streptomyces aureus）， 由駐馬店華中正大有限公司制備并保藏。

1.1.2 初始培養(yǎng)基配方

種子培養(yǎng)基%（kg/L）：玉米淀粉8，酵母粉2，黃豆餅粉4.8，玉米漿0.28，氯化鈉0.2，硫酸銨0.48，碳酸鈣0.64，硫酸鎂0.048，磷酸二氫鉀0.072。

發(fā)酵培養(yǎng)基%（kg/L）：玉米淀粉6，花生餅粉2，酵母粉0.65，黃豆餅粉1，菌體蛋白0.27，氯化鈉0.2，硫酸銨0.67，碳酸鈣0.6，硫酸鎂0.022，淀粉酶0.007，玉米漿1.4，磷酸二氫鉀0.01。

1.1.3 主要儀器及設(shè)備

8m3種子罐，溫州石油化工機(jī)械廠；60m3發(fā)酵罐，溫州石油化工機(jī)械廠；60m3糖罐，溫州石油化工機(jī)械廠；近紅外光譜分析儀（NIRS），福斯華（北京）科貿(mào)有限公司（FOSS）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)方法

（1）種子罐培養(yǎng)方法：種子罐接種后，在溫度26-33℃，罐壓0.040-0.060Mpa條件下培養(yǎng)19-25h。

（2）發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，待種子罐培養(yǎng)結(jié)束，移入發(fā)酵罐后在溫度28-34℃，菌絲長好后降溫至29±3℃培養(yǎng)。過程中pH控制在5.9±0.5，培養(yǎng)壓力控制在0.001-0.040MPa，同時(shí)通過補(bǔ)料控制合適的總糖和氨基氮，培養(yǎng)90-124hr后，發(fā)酵液氨基氮上升、菌絲老化、補(bǔ)糖量、通氨量降低時(shí)，即可正放到提煉進(jìn)行處理。

1.2.2 發(fā)酵液樣品分析與檢測方法

培養(yǎng)過程中每8小時(shí)取一次樣，除pH需用pH計(jì)檢測外，其余各參數(shù)：總糖，氨基氮，效價(jià)均運(yùn)用近紅外光譜分析儀掃描檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析工具：minitab 15.0

1.3 研究過程

1.3.1 部分因子設(shè)計(jì)進(jìn)行初篩試驗(yàn)

利用minitab 15.0軟件進(jìn)行部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)在初始無機(jī)鹽配方的基礎(chǔ)上進(jìn)行，其中初始配方見表1，因考慮到試驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)問題，對試驗(yàn)配方調(diào)整幅度進(jìn)行控制，控制幅度見表2，最終試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表3所示。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子數(shù)5，水平數(shù)12，區(qū)組數(shù)1，仿行數(shù)：1，中心點(diǎn)：1，最終得到17次試驗(yàn)。

1.3.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在部分因子設(shè)計(jì)所得結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)得出獲得最優(yōu)發(fā)酵效能的無機(jī)鹽配方組合并進(jìn)行60m3發(fā)酵罐生產(chǎn)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分因子設(shè)計(jì)試驗(yàn)初篩驗(yàn)證結(jié)果

對部分因子設(shè)計(jì)所得17次試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證后對其放罐效價(jià)及正放產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得知：配方一，配方三，配方六，配方八，配方十二，配方十三，配方十五在17次試驗(yàn)中同時(shí)滿足放罐效價(jià)，干物質(zhì)CTC含量和正放產(chǎn)量在21000μ/ml，210g/kg及7000kg以上（結(jié)果見表4）

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)

對初篩試驗(yàn)獲得的七組配方進(jìn)行第二次上罐試驗(yàn)驗(yàn)證，對所得結(jié)果利用minitab軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到金霉素發(fā)酵過程以30m3的計(jì)料體積最優(yōu)無機(jī)鹽配方為氯化鈉70kg，硫酸銨190kg，碳酸鈣170kg，硫酸鎂7.6kg，磷酸二氫鉀0kg（配比為：氯化鈉0.23%，硫酸銨0.63%，碳酸鈣0.57%，硫酸鎂0.025%，磷酸二氫鉀0%），此配方預(yù)計(jì)所得放罐效價(jià)，干物質(zhì)CTC含量以及正放產(chǎn)量分別為24651μ/ml，209g/kg，7822kg。具體見圖1。

2.3 最優(yōu)無機(jī)鹽配方的初步驗(yàn)證（10批）

按照響應(yīng)優(yōu)化器所得最優(yōu)無機(jī)鹽配方進(jìn)行上罐（60m3）初步驗(yàn)證后得知，優(yōu)化后的無機(jī)鹽配方所得放罐效價(jià)和正放產(chǎn)量較優(yōu)化前分別提高532μ/ml和295kg具體見圖2（a）和圖2（b）。

2.4 最優(yōu)無機(jī)鹽配方的60m3發(fā)酵罐生產(chǎn)推廣情況

通過初步驗(yàn)證結(jié)果得到優(yōu)化后的配方在促進(jìn)金霉素合成提高金霉素發(fā)酵效價(jià)及正放產(chǎn)量存在明顯的優(yōu)勢，所以將此配方在60m3發(fā)酵罐上進(jìn)行全部推廣驗(yàn)證（總批次為36批），最終結(jié)果為放罐效價(jià)和正放產(chǎn)量較優(yōu)化前分別提高852μ/ml和261kg，具體見圖3（a）和圖3（b）。且從圖4可看出，試驗(yàn)罐批與對照罐批pH控制和過程氨基氮變化趨勢以及效價(jià)增長情況差異不明顯，但對照罐批前期糖耗較快，且從DO和粘度來看，對照罐批前期代謝較試驗(yàn)旺盛。

2.5 不同硫酸銨濃度對金霉素菌絲形態(tài)的影響

在本次試驗(yàn)過程中通過對菌絲形態(tài)對比發(fā)現(xiàn)不同的硫酸銨配比對金霉素菌絲形態(tài)有不同影響，當(dāng)硫酸銨配比為0.63%時(shí)，使得菌絲17小時(shí)開始分化出現(xiàn)節(jié)孢子，而0.7%的硫酸銨罐批19小時(shí)并未出現(xiàn)明顯分化現(xiàn)象，且試驗(yàn)批32小時(shí)大量開始分化，而對照批34小時(shí)開始分化出節(jié)孢子。（見圖5）故硫酸銨對金霉素菌絲分化有一定影響，后續(xù)需繼續(xù)研究。[3]

3 結(jié)語

本研究運(yùn)用部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面優(yōu)化方法對金霉素發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同無機(jī)鹽原料（CaCO3，MgSO4，NaCl，（NH4）2S

O4，CaCl2，KH2PO4）濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)配比為氯化鈉0.23%，硫酸銨0.63%，碳酸鈣0.57%，硫酸鎂0.025%，磷酸二氫鉀0%，且單批金霉素發(fā)酵效價(jià)及正放產(chǎn)量較初始配方條件分別提高852μ/ml和261kg，實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)增效的目地。且通過對菌絲形態(tài)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)不同硫酸銨濃度金霉素菌絲分化程度有一定的影響。

4 展望

本研究由于是在實(shí)際生產(chǎn)過程中進(jìn)行，由于考慮到生產(chǎn)效能，且受生產(chǎn)工藝規(guī)程限定，未進(jìn)行單因素跨度較大的試驗(yàn)來確定各個(gè)無機(jī)鹽最適濃度，直接綜合考慮所有無機(jī)鹽濃度，且關(guān)于硫酸銨對金霉素菌絲形態(tài)的影響也未研究徹底，在今后的研究中， 將針對以上不足展開研究，選擇出各個(gè)無機(jī)鹽濃度的單一因素條件下的最佳配比，然后在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行綜合驗(yàn)證， 同時(shí)結(jié)合菌絲形態(tài)研究找到最適的硫酸銨濃度，提高金霉素產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

參考文獻(xiàn)：

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[2]張由恒，等.無機(jī)鹽對多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量影響[J].文章編號(hào)：1001-8689（2016）09-0658-08.

[3]王娟，等.頭孢菌素C發(fā)酵過程中硫酸銨加量對菌絲形態(tài)及其效價(jià)的影響[J].求醫(yī)問藥下半月刊，2011，9（7）.