仿酶固體酸的合成及其纖維素水解性能

王 海 松， 靳 書(shū) 緣， 楊 超

( 大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

纖維素水解產(chǎn)物葡萄糖在食品、醫(yī)藥、日化以及化工領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用。近年來(lái)，固體酸水解纖維素憑借可回收、腐蝕性小等優(yōu)點(diǎn)逐漸引起了人們的關(guān)注。但由于固體酸和纖維素均不溶于水，兩者之間存在嚴(yán)重傳質(zhì)限制，使得固體酸催化水解效率遠(yuǎn)低于均相液體酸[1]。針對(duì)固體酸與纖維素之間的傳質(zhì)障礙問(wèn)題，多篇文獻(xiàn)[2-5]指出，在固體催化劑上引入纖維素結(jié)合官能團(tuán)，合成仿酶型固體催化劑，能提高固體酸的催化性能。Li等[2]以氯甲基聚苯乙烯為載體，通過(guò)對(duì)氨基苯磺酸載體上部分取代的方式引入酸性位點(diǎn)(—SO3H)，氯甲基(—CH2Cl)為結(jié)合官能團(tuán)合成CP-SO3H。該催化劑在120 ℃、48 h條件下水解微晶纖維素，葡萄糖收率為93%。Yang等[1]以交聯(lián)芐基氯微球?yàn)檩d體，采用發(fā)煙硫酸磺化引入磺酸根，氯甲基為結(jié)合官能團(tuán)合成仿酶固體酸。該固體酸在120 ℃水解球磨微晶纖維素24 h，葡萄糖得率為84.9%。Shen等[5]通過(guò)碳化三氯蔗糖與對(duì)甲苯磺酸混合物合成具有纖維素催化位點(diǎn)(—SO3H)和結(jié)合位點(diǎn)(—Cl)的催化劑。該催化劑在離子液體中130 ℃水解微晶纖維素，反應(yīng)1 h總還原糖得率為67.6%。以上文獻(xiàn)均模仿纖維素酶水解過(guò)程中結(jié)合結(jié)構(gòu)域提高纖維素不溶性底物的可及度從而獲得高的水解效率機(jī)理，通過(guò)在固體酸上引入親纖維素的Cl基改善水解纖維素的效率，取得了很好的效果，但是因?yàn)檫^(guò)程復(fù)雜或原料成本問(wèn)題，離產(chǎn)業(yè)化還有些距離，所以本論文將在參考這些文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，以應(yīng)用最廣泛的工業(yè)固體酸催化劑Amberlyst-15(A-15)為原料進(jìn)行氯甲基化改性并評(píng)價(jià)其纖維素的水解效率。

A-15是一種強(qiáng)酸性大孔型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，具有價(jià)廉易得、催化活性高、選擇性高、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)[6]。本研究通過(guò)B1anc氯甲基化反應(yīng)制備氯甲基化Amberlyst-15(A-15-Cl)，重點(diǎn)考察多聚甲醛、無(wú)水四氯化錫、氯磺酸以及反應(yīng)時(shí)間4種因素對(duì)A-15-Cl水解球磨微晶纖維素效果的影響；對(duì)其反應(yīng)工藝參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，并與A-15水解效果進(jìn)行對(duì)比，闡明氯甲基化改性提高纖維素水解效率的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材 料

Amberlyst-15，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硝酸銀(AgNO3)、多聚甲醛((CHO)n)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水四氯化錫(SnCl4)，AR，麥克林；氯磺酸(ClSO2OH)，山東西亞化學(xué)股份有限公司；微晶纖維素，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 氯甲基化固體酸A-15-Cl的制備

取0.5 g A-15與20 mL 1，2-二氯乙烷(CH2ClCH2Cl)于三口燒瓶中，40 ℃下潤(rùn)脹48 h。升溫至55 ℃，加入多聚甲醛、無(wú)水四氯化錫與氯磺酸，機(jī)械攪拌連續(xù)反應(yīng)。

反應(yīng)結(jié)束后取出固體酸用無(wú)水乙醇以及去離子水多次洗滌，直至上清液滴入AgNO3溶液無(wú)白色沉淀生成。在真空干燥箱中烘干得A-15-Cl。

1.3 微晶纖維素的水解

1.3.1 微晶纖維素的成分分析

取0.3 g球磨微晶纖維素于耐壓瓶中，加入3 mL 72% H2SO4，室溫下攪拌2 h，加入84 mL水，混合均勻后，121 ℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，使用SBA-40D生物傳感分析儀檢測(cè)葡萄糖含量。

1.3.2 球磨微晶纖維素

使用低溫星型球磨機(jī)球磨微晶纖維素3 h，通過(guò)使纖維素分子間氫鍵斷裂，來(lái)降低微晶纖維素的結(jié)晶度，提高纖維素的可及度[7]。

1.3.3 水解微晶纖維素

取球磨微晶纖維素0.05 g、固體酸0.1 g與5 mL 水混合，置于15 mL水熱合成反應(yīng)釜中150 ℃反應(yīng)12 h，結(jié)束后離心取液相檢測(cè)葡萄糖含量。

1.3.4 葡萄糖的檢測(cè)

用檸檬酸(顆粒)和氫氧化鈉(顆粒)將水解液pH調(diào)至6.5～7.0后用SBA-40D生物傳感分析儀檢測(cè)葡萄糖質(zhì)量濃度。

葡萄糖得率=(ρV/mw)×100%

式中：ρ為測(cè)得液相葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為水解反應(yīng)加入水的體積，mL；m為微晶纖維素質(zhì)量，mg；w為原料中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 A-15與A-15-Cl表征

A-15與A-15-Cl采用Spectrum One-B型傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行官能團(tuán)定性分析；使用Q50熱重分析儀進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析；表面形貌及化學(xué)元素組成分析采用JSM-7800F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡和X-Max50能譜儀；比表面積、孔體積、孔徑尺寸由ASAP 2020 Plus HD88比表面與孔隙度分析儀測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 A-15的氯甲基化工藝的優(yōu)化

2.1.1 (CHO)n用量的影響

由圖1多聚甲醛用量對(duì)改性A-15-Cl水解微晶纖維素葡萄糖得率的影響可以看出，隨著多聚甲醛用量的增加，葡萄糖得率先增加后減小。當(dāng)加入多聚甲醛的用量為0.25～0.50 g時(shí)，固體酸水解微晶纖維素的葡萄糖得率隨多聚甲醛用量的增加而增加。這是因?yàn)殡S著多聚甲醛的加入，甲醛碳正離子濃度增加，氯甲基化程度增加，提高了固體酸和纖維素的吸附力和可及度，改善了纖維素的水解效率。當(dāng)多聚甲醛用量進(jìn)一步增加時(shí)，葡萄糖得率達(dá)到最高點(diǎn)后開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)樵诼燃谆磻?yīng)中，苯環(huán)上的氯甲基化反應(yīng)與Friedel-Crafts交聯(lián)副反應(yīng)是一對(duì)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，當(dāng)多聚甲醛用量過(guò)多時(shí)，氯甲基化反應(yīng)會(huì)在短時(shí)間內(nèi)完成，這也會(huì)大大增加Friedel-Crafts副反應(yīng)程度，導(dǎo)致樣品氯含量降低[8]。因此，多聚甲醛最佳用量為0.50 g。

圖1 (CHO)n用量對(duì)葡萄糖得率的影響

2.1.2 無(wú)水SnCl4用量的影響

由圖2可知，隨著無(wú)水SnCl4用量的增加，改性A-15-Cl水解微晶纖維素葡萄糖得率先增加后減小。當(dāng)無(wú)水SnCl4用量在0.50～0.75 mL時(shí)，增大無(wú)水SnCl4的用量有利于反應(yīng)體系中烷基碳正離子的生成速率，從而提高體系內(nèi)烷基碳正離子的濃度，利于親電取代反應(yīng)的進(jìn)行，氯甲基化反應(yīng)速率加快，氯甲基化程度增加[8]，進(jìn)而纖維素水解效率提高。無(wú)水SnCl4的用量為0.75 mL時(shí)，葡萄糖得率達(dá)到最大，為58.77%。當(dāng)無(wú)水SnCl4用量在0.75～1.75 mL時(shí)，會(huì)造成整個(gè)反應(yīng)體系中烷基碳正離子的反應(yīng)速率過(guò)快，短時(shí)間內(nèi)存在大量高活性的氯甲基化A-15，從而大大增加了亞甲基橋交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致氯甲基被消耗，氯含量降低[8]，所以葡萄糖得率隨無(wú)水SnCl4的增加而減小。根據(jù)圖中纖維素水解糖得率的趨勢(shì)選擇0.75 mL SnCl4為最佳用量。

圖2 無(wú)水SnCl4用量對(duì)葡萄糖得率的影響

2.1.3 ClSO2OH用量的影響

由圖3可知，隨著氯磺酸用量的增加，改性A-15-Cl水解微晶纖維素葡萄糖得率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。當(dāng)ClSO2OH用量在5～20 mL時(shí)，A-15-Cl 水解微晶纖維素葡萄糖得率由55.17%升至61.17%。這是因?yàn)殡S著ClSO2OH用量的增加，反應(yīng)物分子之間的有效碰撞增加，使反應(yīng)效率更高，隨之氯甲基化程度增加。當(dāng)ClSO2OH用量從20 mL繼續(xù)增加到30 mL時(shí)，A-15-Cl水解微晶纖維素葡萄糖得率基本維持在61%左右不再增加?？赡艿脑蚴钱?dāng)ClSO2OH用量足夠多時(shí)，烷基正離子的數(shù)量對(duì)氯甲基化反應(yīng)的影響逐漸變得不明顯，所以產(chǎn)物的氯甲基化程度變化趨于穩(wěn)定[9]；當(dāng)ClSO2OH用量在20～30 mL時(shí)，A-15的氯甲基化程度增加，但是氯元素的吸附能力達(dá)到最大，此時(shí)葡萄糖的得率取決于A-15-Cl上磺酸根的量[10]。綜上所述，選擇ClSO2OH最佳用量為20 mL。

圖3 ClSO2OH用量對(duì)葡萄糖得率的影響

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

由圖4可知，反應(yīng)6～24 h，A-15-Cl水解微晶纖維素葡萄糖得率逐漸提高，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到48 h時(shí)，A-15-Cl水解微晶纖維素葡萄糖得率基本穩(wěn)定在62%左右。這是因?yàn)椋磻?yīng)6～24 h，A-15苯環(huán)上有足量的活性位點(diǎn)供氯甲基化反應(yīng)，所以氯甲基化程度增加，A-15-Cl水解效率提高。超過(guò)24 h，有可能A-15 氯甲基化反應(yīng)達(dá)到平衡，A-15氯甲基化程度不再增加，也有可能是在24 h時(shí)氯元素的吸附能力達(dá)到最大，繼續(xù)增加氯甲基已不能提高纖維素的水解能力，此時(shí)葡萄糖的得率取決于A-15-Cl上磺酸根的量[10]。所以，氯甲基化反應(yīng)時(shí)間選擇24 h。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)葡萄糖得率的影響

2.2 A-15-Cl水解微晶纖維素的再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)及與A-15的比較

為了驗(yàn)證優(yōu)化工藝條件下制備A-15-Cl水解微晶纖維素的再現(xiàn)性，在獲得的最佳工藝(CH2ClCH2Cl 20 mL，(CHO)n0.50 g，SnCl40.75 mL，55 ℃，24 h)條件下制備改性A-15-Cl，在150 ℃條件下水解微晶纖維素12 h，與未改性A-15的水解微晶纖維素葡萄得率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示在優(yōu)化條件下制備的改性A-15-Cl水解微晶纖維(170 ℃，12 h，固體酸0.05 g，球磨纖維素0.1 g，H2O 5 mL)葡萄糖得率為62.37%，且具有很好的再現(xiàn)性。而未改性A-15水解微晶纖維葡萄糖得率僅為16.19%，改性后的固體酸水解效率相比改性前提高了3.85倍。

2.3 A-15-Cl提高微晶纖維素水解效率的機(jī)理

2.3.1 紅外光譜分析

由圖5A-15 FT-TR譜圖可知，3 412.26 cm-1出現(xiàn)羥基伸縮振動(dòng)特征峰，這屬于磺酸根(—SO3H) 以及樣品中存在水分子中的O—H，在1 161.00和1 034.07 cm-1歸屬于—SO3H中S—O的對(duì)稱和不對(duì)稱伸縮振動(dòng)[11]。證明A-15存在—SO3H的特征吸收峰。圖5中改性的A-15-Cl 相比A-15的最大區(qū)別是，在1 372.54和914.42 cm-1兩處出現(xiàn)氯甲基(—CH2Cl)伸縮振動(dòng)特征吸收峰，證明了改性A-15-Cl中氯甲基的成功引入。但是也有文獻(xiàn)[10,12]指出—CH2Cl的特征吸收峰在1 265和678 cm-1，這是因?yàn)锳-15本身含有的苯環(huán)會(huì)與—CH2Cl上的H形成σ-π超共軛，且苯環(huán)上連有強(qiáng)吸電子基團(tuán)—SO3H，所以—CH2Cl周?chē)娮釉泼芏葴p小，使得—CH2Cl特征吸收峰發(fā)生藍(lán)移[13]。根據(jù)A-15改性前后的FT-TR譜圖分析，可以充分說(shuō)明A-15-Cl的苯環(huán)被引入—CH2Cl。而已有文獻(xiàn)表明氯甲基可作為纖維素水解過(guò)程的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，提高與纖維素表面的氫鍵結(jié)合和可及度[14]，固體酸上的催化基團(tuán)(—SO3H)破壞纖維素單體的連接鍵，像纖維素酶水解過(guò)程一樣改善了纖維素的水解效率，成功實(shí)現(xiàn)了仿纖維素酶水解過(guò)程的設(shè)計(jì)。

圖5 A-15和A-15-Cl的FT-TR譜圖

2.3.2 熱穩(wěn)定性分析

由圖6中固體酸的TG曲線和DTG曲線可知，樣品的質(zhì)量損失主要分3個(gè)階段。在第1階段(低于200 ℃)，質(zhì)量損失主要來(lái)源于樣品中結(jié)合水和自由水的蒸發(fā)[15]。在第2階段(200～350 ℃)，主要是聚苯乙烯鏈的解聚[16]、—SO3H以及—CH2Cl 的分解[14]。在第3階段(400 ℃以上)，質(zhì)量損失主要來(lái)自聚合物主鏈斷裂成小分子，二乙烯基苯發(fā)生降解[16]。圖6(a)圖像表明，A-15-Cl總質(zhì)量損失65.4%略高于A-15總質(zhì)量損失64.57%，這主要是因?yàn)锳-15-Cl相對(duì)于A-15 增加了氯甲基。但在其他降解溫度和變化趨勢(shì)方面基本沒(méi)有變化，說(shuō)明A-15的氯甲基化沒(méi)有改變其熱穩(wěn)定性。

2.3.3 掃描電鏡圖像

由圖7(b)可以看出，A-15是由顆粒聚集而成的球狀樹(shù)脂，顆粒之間的縫隙形成了A-15的孔道。對(duì)比圖7(a)和(c)發(fā)現(xiàn)，A-15-Cl相對(duì)于A-15表面更加松散、孔數(shù)增加。觀察圖7(b)和(d)明顯發(fā)現(xiàn)A-15-Cl相對(duì)于A-15內(nèi)部顆粒體積減小，顆粒間空隙數(shù)量增加。A-15-Cl孔數(shù)增多的原因可能是氯甲基化反應(yīng)中加入的氯磺酸具有腐蝕性，使其組成顆粒體積減小，進(jìn)而增加了固體酸的孔隙數(shù)量，增大了反應(yīng)物的比表面積。這也很好解釋了改性A-15-Cl改善微晶纖維素葡萄糖水解效率的原因。

(a) TG

(b) DTG

(a) A-15表面圖

(c) A-15-Cl表面圖

2.3.4 BET及EDS元素分析

從表1中EDS檢測(cè)A-15和A-15-Cl表面S和Cl含量的數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，改性前后表面的磺酸含量變化不大，但成功引入對(duì)纖維素具有親和性的氯基，與前期紅外光譜分析結(jié)果是一致的。另外從BET檢測(cè)的數(shù)據(jù)可以看出，A-15-Cl相較于A-15平均孔徑減小4.52 nm。主要是因?yàn)槁然撬峋哂懈g性，使A-15-Cl的組成顆粒減小，隨之大孔縫隙數(shù)減少，所以平均孔徑減小。由表1可得A-15-Cl的比表面積為65.60 m2/g，相比A-15 比表面積46.36 m2/g提高了41.51%，而且總孔隙體積也略有增加。這是因?yàn)锳-15-Cl的組成顆粒體積減小，顆粒之間孔隙數(shù)量增多，比表面積增加，該結(jié)果與電鏡分析的結(jié)果一致。A-15-Cl水解球磨微晶纖維素的得率增加也得益于其介孔增加，使寡糖進(jìn)入孔道進(jìn)而增加有效面積，該理論在多篇文獻(xiàn)中都得到證實(shí)[7，17]。

表1 A-15和A-15-Cl的BET及EDS數(shù)據(jù)

由圖8可見(jiàn)，A-15和A-15-Cl的N2吸附-脫附等溫線基本一致，符合Ⅱ型等溫線且出現(xiàn)H1型滯后環(huán)。Ⅱ型等溫線說(shuō)明樣品存在分布均勻的兩端開(kāi)口的管徑圓筒孔狀，H1型滯后環(huán)說(shuō)明樣品中存在分布均勻的介孔和大孔[17]。由兩圖孔徑分布圖可知，A-15-Cl在孔徑為5.5 nm處比A-15 多出現(xiàn)一個(gè)峰，表明A-15-Cl相對(duì)于A-15孔徑的增多。該結(jié)果與SEM圖像一致，進(jìn)一步證實(shí)氯甲基化反應(yīng)提高了固體酸介孔含量。

3 結(jié) 論

以無(wú)水SnCl4為催化劑，(CHO)n/ClSO2OH為氯甲基化試劑，對(duì)工業(yè)化固體酸A-15進(jìn)行改性，得到最有利于微晶纖維素水解的氯甲基化條件：CH2ClCH2Cl 20 mL，(CHO)n0.50 g，無(wú)水SnCl40.75 mL，ClSO2OH 20 mL，溫度55 ℃，時(shí)間24 h。此條件下制得A-15-Cl在150 ℃下水解纖維素12 h葡萄糖得率達(dá)到62.37%。FT-IR、TGA、BET的表征結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)A-15氯甲基化反應(yīng)，成功地實(shí)現(xiàn)了仿酶固體酸親纖維素的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的引入，極大地改善了固體酸與纖維素的傳質(zhì)障礙，提高了纖維素的水解效率，為將來(lái)工業(yè)固體酸在纖維素水解上的應(yīng)用提供了新的設(shè)計(jì)思路。

(a) A-15

(b) A-15-Cl