羅格列酮對慢性阻塞性肺疾病炎癥損傷的保護(hù)機(jī)制研究

陳麗朱,羅 京

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以氣流受限不可逆為特征的慢性炎癥性肺部疾病[1]。研究顯示，其發(fā)病率高,預(yù)后差,在美國，每年約有10 000人死于COPD,高居美國疾病死亡率第4位[2]。在我國，COPD患病率在40歲以上人群約為9.9%,因此，控制或減少COPD是一個重大的公共健康問題。研究顯示，降糖藥羅格列酮具有抗炎、抑制腫瘤、拮抗凋亡和調(diào)節(jié)免疫等功效[3-4],本研究擬用羅格列酮干預(yù)COPD大鼠,探討羅格列酮對COPD大鼠的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑和設(shè)備 健康成年雄性SD大鼠30只,體重(220±20)g,購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。羅格列酮(Sigma,美國);脂多糖(Sigma,美國,1 mg/ml);水合氯醛(武漢谷歌生物)。PI3K(CST，USA)、AKT(CST，USA)、p-AKT(CST，USA)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(RD,美國);引物(擎科生物),逆轉(zhuǎn)錄儀(Eppendorf),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia，USA),紫外分光光度計(Thermo fisher,美國),顯微鏡(Olympus BX51,日本)和成像系統(tǒng)(HITMAS-30,日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 30只SD大鼠隨機(jī)均分為對照組(C組)、模型組(COPD組)和羅格列酮組(RGZ組)。采用煙霧暴露聯(lián)合氣道滴入脂多糖構(gòu)建大鼠COPD模型。RGZ組在煙霧暴露前30 min給予羅格列酮(20 μg/只)灌胃,C組和COPD組給予等量生理鹽水灌胃,共30 d,具體劑量參考文獻(xiàn)[5]。COPD組和RGZ組大鼠每天置于煙室4次,每次1 h,共30 d。從第15天起，RGZ組和COPD組大鼠氣道內(nèi)注入200 μl脂多糖,C組正常飼養(yǎng),具體操作參考文獻(xiàn)[5]。在第30天,利用腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后,行氣管插管,采用AniRes2003動物肺功能呼吸系統(tǒng)測定各組大鼠肺順應(yīng)性(CL)、第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3%)與用力肺活量(FVC)之比和用力呼氣流量(MMEF);此外,用PBS灌洗左側(cè)支氣管肺泡。將BALF離心、重懸,送醫(yī)院檢驗(yàn)科，利用血細(xì)胞分析儀檢測中性粒細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞之比,并收集右肺和血清,-80 ℃冰箱凍存。

1.3 肺組織病理檢查 取肺組織放置于4%甲醛固定48 h后，石蠟包埋,切片,制片，HE染色觀察肺組織病理形態(tài)。

1.4 ELISA檢測血清中和BALF中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平 取各組血清和BALF，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測血清和BALF中IL-6、TNF-α和IL-1β表達(dá)水平。

1.5 RT-PCR檢測肺組織炎癥細(xì)胞因子mRNA水平 取右肺組織,提取RNA，檢測RNA含量,反轉(zhuǎn)錄,上樣,IL-6、IL-1β和TNF-α引物序列如表1所示,擴(kuò)增條件為:變性94 ℃ 10 s→退火59 ℃ 45 s→60 ℃ 1 min×35個循環(huán),利用圖像分析儀器進(jìn)行掃描分析,具體步驟參見文獻(xiàn)[6]。

1.6 Western blot檢測肺組織蛋白表達(dá) 取肺組織,提取總蛋白。采用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,按說明書進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),檢測PI3K、AKT和p-AKT表達(dá)、最后采用ECL試劑盒顯影并成像。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,具體步驟參見文獻(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 C組大鼠毛發(fā)白皙,光滑,活動性良好,無咳嗽,飲食良好,體重增加率為81.12%±10.23%,COPD組大鼠毛發(fā)萎黃,大量脫落,活動性差,經(jīng)常出現(xiàn)咳嗽,飲食明顯減少,體重增加率為55.13%±5.12%,一般情況較對照組明顯變差。RGZ組大鼠毛發(fā)少量萎黃和脫落,活動性較差,偶爾出現(xiàn)咳嗽,飲食欠佳,體重增加率為72.46%±6.21%,一般情況優(yōu)于COPD組。

2.2 羅格列酮對各組大鼠肺組織病理形態(tài)的影響 C組肺泡壁完整,肺泡間隔均勻一致,肺泡腔充氣好,無炎癥細(xì)胞浸潤。COPD組與C組比較,肺泡間隔明顯增厚,肺泡壁厚度明顯變薄,肺泡腔萎陷,管腔變窄,萎縮肺泡陷明顯增多,可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。RGZ組與COPD組比較,肺泡間隔大多正常,肺泡腔充氣良好,可見少量萎縮肺泡,炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少,見圖1。

2.3 羅格列酮對各組大鼠肺功能的影響 與C組比較,COPD組大鼠CL、FEV0.3%/FVC和MMEF均明顯降低(P<0.05);與COPD組比較,RGZ組大鼠CL、FEV0.3%/FVC和MMEF均明顯增高(P<0.05),提示羅格列酮可明顯改善COPD大鼠肺功能,見表2。

2.4 羅格列酮對各組大鼠肺臟中PI3K、p-AKT和AKT表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果顯示,與C組比較,COPD組大鼠肺臟PI3K和p-AKT表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),而兩組AKT表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與COPD組比較，RGZ組大鼠肺臟中PI3K和p-AKT表達(dá)進(jìn)一步增加(P<0.05),而兩組AKT表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。結(jié)果顯示，羅格列酮可促進(jìn)PI3K/AKT信號通路激活。

表1 RT-PCR引物序列

表2 羅格列酮對CL、FEV0.3%/FVC和MMEF的影響

注：與C組比較,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

圖1 HE檢測羅格列酮對肺組織病理損傷的影響(200×)

圖2 Western blot檢測羅格列酮對PI3K、AKT、p-AKT表達(dá)水平的影響

注：與C組比較,*P<0.05,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

2.5 羅格列酮對各組大鼠BALF中白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比的影響 與C組比較,COPD組BALF中白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比均明顯增加(P<0.05);與COPD組比較,RGZ組BALF中白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比均明顯降低(P<0.05)。見表3。

2.6 羅格列酮對各組大鼠肺臟TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)的影響 與C組比較，COPD組肺臟中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平均明顯增高(P<0.05);與COPD組比較,RGZ組肺臟中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平均明顯減少(P<0.05)，見表4。

表3 羅格列酮對BALF中白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比的影響

注：與C組比較,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

表4 羅格列酮對TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平的影響

注：與C組比較,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

2.7 羅格列酮對各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)量的影響 與C組比較，COPD組血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)量均明顯升高(P<0.05);與COPD組比較,RGZ組血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)，見表5。

2.8 羅格列酮對各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)量的影響 與C組比較，COPD組BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)量均明顯升高(P<0.05);與COPD組比較,RGZ組BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)，見表6。

表5 羅格列酮對血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)量的影響

注：與C組比較,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

表6 羅格列酮對BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)量的影響

注：與C組比較,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

3 討論

COPD是臨床上常見的一種呼吸道氣流嚴(yán)重受限且不能完全可逆的支氣管肺部疾病,其氣流受限表現(xiàn)為緩慢而持續(xù)的進(jìn)展。其致病病因包括機(jī)體抵抗力下降、過敏、反復(fù)感染、吸入有毒有害物質(zhì)以及反復(fù)嚴(yán)重感染等[1-2]。其病理基礎(chǔ)為肺實(shí)質(zhì)和支氣管的慢性炎癥,緩慢而持續(xù)的進(jìn)展,引發(fā)肺功能下降乃至衰竭[7-9]。因此，抑制或減輕肺部炎癥是改善COPD的有效治療途徑。

羅格列酮為噻唑烷二酮類抗糖尿病藥,其作用機(jī)制為通過提高機(jī)體對胰島素的敏感性以控制高血糖。羅格列酮是過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPAR-γ)的強(qiáng)效激動劑之一，而PPAR-γ廣泛分布于肺組織等器官[3-4]。既往研究顯示，PPAR-γ激動劑可通過激活PPAR-γ核受體,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、自由基清除及血糖降解等[3-4]。因此，羅格列酮可能有助于改善COPD。

本實(shí)驗(yàn)通過煙熏暴露聯(lián)合氣管內(nèi)滴入(脂多糖)的方法構(gòu)建大鼠COPD模型。模型組大鼠一般情況表現(xiàn)為毛發(fā)萎黃,大量脫落,活動性差,經(jīng)常出現(xiàn)咳嗽,飲食明顯減少,體重增加,病理學(xué)結(jié)果顯示，大鼠肺泡間隔明顯增厚,肺泡壁厚度明顯變薄,肺泡腔萎陷,管腔變窄,萎縮肺泡陷明顯增多,可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。肺功能檢測結(jié)果顯示，CL、FEV0.3%/FVC和用力呼氣流量均明顯降低,肺組織、血清和BALF TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)量明顯增加,BALF中白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比均明顯增高,這與既往研究報道一致[6],提示成功模擬構(gòu)建了COPD大鼠模型。本研究進(jìn)一步證實(shí)了COPD可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的激活和炎癥細(xì)胞的浸潤,肺組織病理損傷,肺功能降低及臨床不適癥狀的出現(xiàn),嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量乃至預(yù)后。羅格列酮預(yù)處理可明顯改善大鼠一般狀態(tài),減輕肺組織病理結(jié)構(gòu)改變和肺功能的降低,減輕炎癥細(xì)胞因子表達(dá)和炎癥細(xì)胞浸潤。因此，羅格列酮對COPD大鼠有明顯的保護(hù)作用,其作用機(jī)制與抑制炎癥相關(guān),但具體機(jī)制不明。

PI3K是體內(nèi)介導(dǎo)信號傳遞的重要分子,可通過磷酸化其下游的蛋白激酶B(AKT)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，如增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、炎癥和趨化等，并在COPD等呼吸道疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[10-11]。結(jié)果顯示，COPD可以促進(jìn)PI3K/AKT信號通路的激活,而羅格列酮可以進(jìn)一步促進(jìn)PI3K/AKT的激活,這與既往研究顯示PPAR-γ激動劑可促進(jìn)PI3K/AKT信號通路的激活一致。

綜上所述,羅格列酮可通過抑制炎癥而對COPD有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與激活PI3K/AKT信號通路相關(guān)。本研究為臨床防治COPD提供了新的選擇。