五味子乙素通過Traf6/TAK1信號(hào)通路介導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡

王金橋，鄧銀芝

0 引言

五味子乙素(Schisandrin B)主要提取于木蘭科植物五味子中木質(zhì)素，前期研究已確認(rèn)其具有較好的生物活性[1]，主要表現(xiàn)在保肝護(hù)肝，有較強(qiáng)抗炎、清除氧自由基、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力和抗衰老等作用[2-5]。有報(bào)道，五味子乙素還表現(xiàn)出抗腫瘤活性，可以通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移，可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的周期和凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞，還可以下調(diào)cyclin D1 mRNA的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞[6-9]。研究表明，五味子乙素可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡，并且可以破壞細(xì)胞間和基底膜黏附性及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞間的穩(wěn)定性，起到抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力[10-12]。但是，五味子乙素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本文以人胃癌細(xì)胞HGC27為研究對(duì)象，探討五味子乙素介導(dǎo)HGC27細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用及對(duì)Traf6/TAK1信號(hào)通路的影響。

1 材料及方法

1.1 藥品、主要試劑和儀器 人胃癌HGC27細(xì)胞株購自上海素爾生物科技有限公司；五味子乙素(杭州臨安天鴻生物科技有限公司，批號(hào)：5521-65-6，純度≥98%)；CCK8試劑盒(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：WH1199)；Annexin-FITC凋亡試劑盒(廣州碧云天生物試劑公司，批號(hào)：P0012S-07)；Bax、Bcl-2、Traf6、TAK1、p-TAK1及β-actin抗體購自美國(guó)Sigma公司；Victor3 1420 Multilable Counter酶標(biāo)儀(DX540，美國(guó))；SDS-PAGE凝膠電泳(北京六一儀器廠，型號(hào)：DYCZ-24DN)；雙色紅外激光成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HGC27細(xì)胞在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃，每隔2～3 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，接種后24 h取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HGC27細(xì)胞分為空白對(duì)照組(A組)、12 μg/ml五味子乙素組(B組)、24 μg/ml五味子乙素組(C組)及48 μg/ml五味子乙素組(D組)。用二甲基亞砜(DMSO)溶解五味子乙素，冷凍待用。其中A組細(xì)胞加入相同體積的培養(yǎng)基，細(xì)胞接種24 h后，加入不同濃度的五味子乙素干預(yù)細(xì)胞，收集細(xì)胞用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 HGC27細(xì)胞接種于96孔板，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，當(dāng)藥物干預(yù)細(xì)胞24、48、72 h后，吸去舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μl CCK8試劑，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶聯(lián)免疫分析儀于450 nm處測(cè)定各孔的吸光度值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集經(jīng)不同濃度處理后的HGC27細(xì)胞48 h后，用無菌的PBS清洗細(xì)胞2次，2 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞，加入1 μl Annexin-FITC混勻后，加入5 μl Propidium Iodide混勻；避光反應(yīng)5 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Trfa6、TAK1及p-TAK1蛋白表達(dá)水平 HGC27細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物處理48 h后，消化收集細(xì)胞，提取蛋白并檢測(cè)蛋白濃度。每孔上樣30 μg進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳，然后電轉(zhuǎn)至NC膜，脫脂奶粉封閉1 h；進(jìn)行一抗孵育，用TBST洗膜，每10 min清洗1次，共洗3次，將NC膜放入稀釋好的Bax、Bcl-2、Trfa6、TAK1及p-TAK1抗體(1∶1 000稀釋)中，4 ℃搖動(dòng)過夜；TBST洗膜后，將NC膜放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中(1∶3 000)，室溫孵育1.5 h；TBST洗膜3次后進(jìn)行蛋白表達(dá)量分析。

2 結(jié)果

2.1 五味子乙素對(duì)HGC27細(xì)胞增殖抑制率的影響 對(duì)于同一藥物作用時(shí)間點(diǎn)，3種劑量的五味子乙素可以顯著抑制細(xì)胞的增殖，藥物干預(yù)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著藥物濃度升高，細(xì)胞增殖抑制率增加，表現(xiàn)出劑量依賴性。對(duì)于同一組五味子乙素劑量而言，隨著藥物干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率升高，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性。見表1。

表1 各組HGC27細(xì)胞增殖抑制率比較(%)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與24 h時(shí)比較，▽P<0.05；與48 h時(shí)比較，▲P<0.05

2.2 五味子乙素對(duì)HGC27細(xì)胞凋亡率的影響 B組(12.88%±1.23%)、C組(19.62%±1.54%)、D組(38.40%±2.85%)細(xì)胞凋亡率顯著高于A組(1.60%±0.43%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藥物干預(yù)組兩兩比較，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且細(xì)胞凋亡率隨著藥物干預(yù)濃度的升高而增加，表現(xiàn)出濃度依賴性。見圖1。

圖1 不同組別間細(xì)胞HGC27細(xì)胞凋亡情況比較

2.3 五味子乙素對(duì)HGC27細(xì)胞中凋亡蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果表明，五味子乙素可以誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并且Bax、Bcl-2表達(dá)量隨著藥物干預(yù)濃度的升高而發(fā)生顯著變化(P<0.05)，呈現(xiàn)出濃度依賴性。見圖2。

2.4 五味子乙素對(duì)HGC27細(xì)胞中Traf6/TAK1信號(hào)通路的影響 結(jié)果表明，五味子乙素可以顯著抑制Traf6、p-TAK1蛋白的表達(dá)，并且Traf6、p-TAK1蛋白表達(dá)量隨著藥物干預(yù)濃度的升高而顯著降低(P<0.05)，呈現(xiàn)出濃度依賴性，說明五味子乙素能夠顯著抑制HGC27細(xì)胞中Traf6/TAK1信號(hào)通路的活化，起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。見圖3。

圖2 不同組別間Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，

△P<0.05

圖3 不同組別間Traf6、p-TAK1蛋白表達(dá)水平的比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，

△P<0.05

3 討論

五味子乙素是從傳統(tǒng)中藥五味子中提取的活性物質(zhì)，早期研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素具有抗腫瘤活性[6-9]，對(duì)膀胱癌、前列腺癌及乳腺癌等腫瘤具有抑制作用。但是關(guān)于五味子乙素對(duì)人胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡等作用及其作用機(jī)制尚未得到證實(shí)。本研究探討了五味子乙素對(duì)人胃癌HGC27細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其可能作用的機(jī)制，結(jié)果表明，不同濃度五味子乙素作用HGC27細(xì)胞后，可以顯著抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且均表現(xiàn)出濃度依賴性，證實(shí)五味子乙素能夠降低HGC27細(xì)胞的存活率，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

生理?xiàng)l件下，細(xì)胞的增殖和凋亡保持一種動(dòng)態(tài)平衡，如果這種平衡發(fā)生變化，則會(huì)引起腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生，然而細(xì)胞外環(huán)境因素通過膜受體介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)，影響細(xì)胞內(nèi)有關(guān)基因的表達(dá)水平變化來調(diào)控細(xì)胞凋亡。較多的信號(hào)傳導(dǎo)通路參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展中。轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β活化激酶1(TAK1)受外界環(huán)境因素的變化可以介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，多種細(xì)胞因子(如IL-1、TGF-β、TLR、CD4及B細(xì)胞受體等)介導(dǎo)的信號(hào)均可通過活化TAK1傳導(dǎo)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Traf6轉(zhuǎn)基因小鼠中，當(dāng)Traf6表達(dá)水平上升時(shí)，可以促進(jìn)TAK1的磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥、凋亡及氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五味子乙素能明顯抑制Trfa6/TAK1信號(hào)通路的活化，主要是通過降低pTraf6和p-TAK1蛋白的表達(dá)，說明五味子乙素可以通過調(diào)控Trfa6/TAK1信號(hào)通路介導(dǎo)HGC27細(xì)胞的凋亡。Bax是一種促凋亡蛋白，而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白[15]，二者在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起著十分重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素可以明顯誘導(dǎo)Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)HGC27細(xì)胞凋亡。

綜上所述，五味子乙素能夠明顯抑制人胃癌HGC27細(xì)胞的增殖，促使其凋亡，其機(jī)制可能與五味子乙素抑制Trfa6/TAK1信號(hào)通路活化，繼而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。