電針對大鼠失神經(jīng)腓腸肌中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/70KD核糖體蛋白S6激酶信號通路的影響①

吳夢佳，唐成林，黃思琴，安薈羽，譚程方，邱麗，朱正威，楊之雪

1.重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，重慶市400016；2.中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市400016通訊作者：唐成林。E-mail：cytcl996@163.com

失神經(jīng)骨骼肌萎縮是指由于失去神經(jīng)的支配和營養(yǎng)作用，導致骨骼肌出現(xiàn)肌肉質(zhì)量和容積不斷流失、內(nèi)分泌及運動功能障礙的一種持續(xù)性病理狀態(tài)，嚴重影響患者正常生活[1]。若治療不及時，靶肌肉失去活性，將發(fā)生不可逆的失神經(jīng)性肌萎縮[2]。肌蛋白的合成代謝小于降解代謝是骨骼肌質(zhì)量減少和發(fā)生骨骼肌萎縮的主要原因之一[3]。治療骨骼肌萎縮，或通過抑制肌蛋白降解，或促進肌蛋白合成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，電針能通過上調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路，促進萎縮骨骼肌中肌衛(wèi)星細胞增殖；并通過下調(diào)萎縮骨骼肌中叉頭蛋白轉錄因子3A和肌萎縮F-box蛋白的表達，抑制骨骼肌蛋白降解，延緩失神經(jīng)肌萎縮。

本研究觀察電針對萎縮腓腸肌中mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR,Ser2448)、70KD核糖體蛋白S6激酶(70-KD ribosomal protein S6 kinase,p70S6K)和磷酸化p70S6K(p-p70S6K,Thr389)蛋白表達的影響，從mTOR/p70S6K蛋白合成信號通路的角度，探討電針延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠18只，鼠齡8周，體質(zhì)量270～290 g，購于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK渝2012-0002，代養(yǎng)于SPF級動物房。

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將大鼠編號1～18，計算機生成18個兩位隨機數(shù)字，分別對應1個編號；將隨機數(shù)從小到大排列，序號1～6為假手術組，7～12為模型組，13～18為電針組。

實驗過程中動物處置嚴格按照重慶醫(yī)科大學倫理委員會規(guī)定進行。

1.2 主要試劑與儀器

mTOR、p70S6K一抗：美國R&D SYSTEMS公司。p-mTOR、p-p70S6K一抗：美國AFFINITY BIOSCIENCES公司。Trizol總RNA提取試劑盒，RR037A逆轉錄試劑盒，SYBR Premix Ex Taq TMII，mTOR、p70S6K引物合成：日本TAKARA公司。

漢醫(yī)牌無菌針灸針：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。SDZ-II型電子針治療儀：蘇州醫(yī)療用品有限公司。柔軟型實驗大鼠固定器：溫州原上草醫(yī)療科技有限公司。AL204型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。低溫高速離心機：美國SIGMA公司。實驗室純水系統(tǒng)：上海和泰儀器有限公司。電泳儀：成都百樂科技有限公司。Thermo ND 2000超微量核酸蛋白測定儀、Odyssey FC成像系統(tǒng)：上海GENE公司。T100TMPCR儀、CFX PCR檢測系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司。CellSens Standard圖像采集軟件、BX53普通正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 造模方法

制備鉗夾大鼠坐骨神經(jīng)腓腸肌萎縮模型[6]。模型組和電針組大鼠4%水合氯醛8 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥固定于手術臺上，右后肢手術區(qū)消毒，常規(guī)備皮；于坐骨結節(jié)下緣斜向切口6～8 mm，沿肌肉紋理走向鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)；取16 cm長持針器鉗夾坐骨神經(jīng)中段，全齒共鉗夾3次，每次鉗夾持續(xù)10 s，間隔10 s，造成寬3.0 mm急性神經(jīng)損傷，肉眼可見神經(jīng)軸索透明，但外膜完整?？p合切口，碘伏消毒，復溫促醒。

假手術組只暴露神經(jīng)，不行坐骨神經(jīng)鉗夾術。

1.4 電針干預

造模后第2天，電針組用大鼠固定器[7]固定，根據(jù)《實驗針灸學》方法[8]，選右足三里、環(huán)跳，針灸針直刺5～7 mm，接電針儀，連續(xù)波，1.0 mA，2 Hz，刺激10 min，見大鼠下肢輕微震動。每天1次，連續(xù)干預2周。

假手術組和模型組每天相同時間同法固定，但不行電針干預。

1.5 標本采集

干預2周后，各組4%水合氯醛8 ml/kg腹腔注射麻醉，手術完整剝離雙側腓腸肌，吸干表面殘血。腓腸肌組織均分2份，一份固定于4%多聚甲醛中，用于形態(tài)學檢測；一份保存于-80℃冰箱待測。

1.6 檢測方法

1.6.1 濕重比

手術完整剝離雙側腓腸肌，清除多余肌腱及血管，電子天平稱取肌濕重，記錄雙側濕重，計算患/健側濕重比。

1.6.2 腓腸肌纖維橫截面積和直徑

取出經(jīng)4%多聚甲醛固定的腓腸肌，沖洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明45 min，浸蠟并包埋，制備石蠟切片，厚4 μm，烘干。烤片、脫蠟，蘇木素染色2 min，沖洗2 min；伊紅染色1 min，沖洗，鏡下觀察染色情況。封片，晾干。400倍光學顯微鏡下觀察組織切片，每張切片隨機選取4個視野拍照，Image-Pro Plu 6.0圖像分析軟件計算腓腸肌纖維的橫截面積和直徑。

1.6.3 Western blotting

取-80℃冰箱保存的待測組織50 mg，提取蛋白，調(diào)勻濃度，配置12%凝膠，室溫待凝15 min，60 V預電泳20 min，120 V上樣電泳100 min，300 mA轉膜90 min，室溫搖床封閉2 h。加mTOR(1∶1000)、p70S6K(1∶1000)、p-mTOR(1∶1000)、p-p70S6K(1∶1000)一抗4℃冰箱過夜，二抗(1∶1000)室溫搖床孵育1 h，TBST清洗3次，每次15 min，化學發(fā)光2 min，以GAPDH為內(nèi)參，Odyssey FC成像系統(tǒng)成像分析計算條帶相對灰度值。1.6.4實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)

取-80℃冰箱待測組織50 mg，Trizol液提取總RNA，加入異丙醇沉淀10 min，12,000 r/min離心15 min，75%酒精清洗，自然晾干；加入無酶水，彈勻。充分清洗超微量核酸蛋白測定儀探頭5次，記錄總RNA純度和污染值，按比例稀釋。使用SYBR Green配制反應體系，合成反應體系，彈勻，離心后行逆轉錄：37℃15 min，85℃5 s，4℃+∞。96孔板加樣，標板，上機行qPCR反應：90℃30 s，95℃5 s，60℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。使用CFX Manager 3.1軟件讀取Ct值。

上下游引物序列如下。

mTOR：上游5'-AAT GGG CAC GAG TTT GTT TTC C-3'；下游5'-CGA GTT GGT GGA CAG AGG AAT G-3'。

p70S6K：上游5'-CAG CCC CGA TGA CTC AAC TCT C-3'；下游5'-GCG TTC GTG GGC TAC CAA TAA-3'。

β-actin：上游 5'-ACG GTC AGG TCA TCA CTA TCG-3'；下游5'-GGC ATA GAG GTC TTT ACG GAT G-3'。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 肌濕重比

與假手術組相比，模型組腓腸肌濕重比顯著降低(P＜0.001)，電針組明顯高于模型組(P＜0.01)。見表1。

2.2 形態(tài)學

假手術組右側肌纖維呈規(guī)則多邊形，無細胞核內(nèi)移及外泄情況，形態(tài)飽滿正常。模型組肌纖維邊緣不規(guī)則，細胞核內(nèi)移或外泄，肌纖維縮小。電針組較模型組肌纖維邊緣規(guī)則，細胞核內(nèi)移和外泄減少。見圖1。

與假手術組相比，模型組右側腓腸肌纖維橫截面積和直徑顯著降低(P＜0.001)，電針組顯著高于模型組(P＜0.001)。見表1。

圖1 各組大鼠右側腓腸肌纖維病理學改變(HE染色，bar=50 μm)

表1 各組腓腸肌萎縮指標比較

2.3 Western blotting

與假手術組相比，模型組右側腓腸肌mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K蛋白表達明顯升高(P＜0.01)；電針組高于模型組(P＜0.05)。見圖2、表2。

2.4 qPCR

與假手術組相比，模型組右側腓腸肌mTOR、p70S6K基因表達升高(P＜0.05)；電針組高于模型組(P＜0.05)。見表3。

表3 大鼠腓腸肌中相關基因表達比較(2-△△Ct)

圖2 各組大鼠腓腸肌Western blotting

3 討論

失神經(jīng)性骨骼肌萎縮導致的肢體痿軟、酸困無力屬中醫(yī)學“痿癥”范疇[9]。《靈樞·根結》認為：“痿疾者，取之陽明?！弊闳铩h(huán)跳為治療下肢癱瘓、肌肉痿痹的要穴。研究表明，電針足三里和環(huán)跳能誘導腓腸肌出現(xiàn)適應性肥大，促進肌衛(wèi)星細胞分化，提高骨骼肌運動耐力[10]；并通過抑制過度激活的自噬水平，延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮[11]。

肌蛋白合成代謝的正常對維持骨骼肌質(zhì)量的穩(wěn)定十分重要[12]。mTOR/p70S6K信號通路是促進蛋白質(zhì)合成的主要通路[13]。mTOR/p70S6K通路抑制，不利于肌細胞的分化和肌管的肥大[14]；激活此通路將對肌肉生長起促進作用[15]。

mTOR是維持肌肉穩(wěn)態(tài)、促進肌肉再生的關鍵因子[16]，也是參與調(diào)節(jié)mRNA翻譯的主要信號轉導樞紐[17]，p-mTOR是其持續(xù)活化的標志。電針能上調(diào)衰老骨骼肌中mTOR和p-mTOR表達，促進蛋白合成，延緩衰老性骨骼肌萎縮[18]。

mTOR激活下游效應分子p70S6K、真核細胞翻譯啟動因子4E結合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)和真核細胞翻譯啟動因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIf4E)[19]。在促進蛋白質(zhì)合成的過程中，p70S6K與mTOR的協(xié)同性更好[20]。p70S6K被p-mTOR激活，繼而發(fā)生磷酸化，啟動蛋白翻譯過程[21]，協(xié)調(diào)細胞增殖分化。對8月齡增齡性大鼠連續(xù)預防性電針干預6個月，能上調(diào)mTOR和p70S6K表達，促進肌蛋白翻譯與合成，從而減緩增齡性大鼠骨骼肌萎縮[22]。

在重新接受神經(jīng)支配的過程中，維持骨骼肌質(zhì)量的穩(wěn)定和活性，延緩其萎縮速度，是保持骨骼肌功能正常的關鍵。本研究表明，失神經(jīng)肌萎縮2周后，大鼠腓腸肌中mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K的表達升高，提示腓腸肌啟動自我修復；而電針能進一步上調(diào)mTOR/p70S6K信號通路相關蛋白表達并刺激其活化，促進肌蛋白翻譯與合成，延緩腓腸肌質(zhì)量下降。

綜上所述，失神經(jīng)骨骼肌萎縮后，電針能上調(diào)骨骼肌中mTOR、p70S6K蛋白及基因表達，進一步調(diào)控其磷酸化水平，激活mTOR/p70S6K信號通路，促進肌蛋白翻譯與合成，維持骨骼肌質(zhì)量和容積，達到延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的目的。