石榴耐鹽性研究與指標(biāo)篩選

劉翠玉， 閆 明， 黃賢斌，苑兆和

（1.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210037；2.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京210037）

近年來，土壤鹽漬化問題日益突出，鹽脅迫已成為限制農(nóng)、林、牧業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有20%的耕地和50%的灌溉土地受到鹽漬化的威脅，且面積仍在不斷擴(kuò)大［1-2］。中國鹽漬土總面積約3.6×107hm2，占全國可利用土地面積的4.88%，主要分布在西北、華北、東北及沿海地區(qū)［1］。 鹽漬環(huán)境可能會(huì)抑制某些植物的生長發(fā)育［3］， 造成細(xì)胞水分虧缺［4］， 離子失衡［5］， 滲透作用失調(diào)［6］，抗氧化酶系統(tǒng)紊亂［7］，光合作用改變［8］等。鹽脅迫對植物的毒害作用主要通過滲透脅迫、離子毒害、營養(yǎng)虧缺及其綜合作用［4,9-12］。研究表明：植物響應(yīng)鹽脅迫的生理機(jī)制主要有離子外排與區(qū)隔化、滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除、光合作用改變、內(nèi)源激素調(diào)節(jié)等［4-5，13］。因此，深入研究植物的耐鹽機(jī)理并提高植物的耐鹽性已經(jīng)成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。石榴Punica granatum作為集經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)、藥用、觀賞與生態(tài)價(jià)值于一身的優(yōu)良果樹［14］，耐鹽堿能力強(qiáng)，常用作鹽堿地造林先鋒樹種［15-16］，多種植于干旱和半干旱地區(qū)［14，17］。也有報(bào)道認(rèn)為：石榴是中度耐鹽樹種，利用鹽水灌溉可以提高石榴的果實(shí)品質(zhì)［18-19］。鹽脅迫對石榴不同品種的生長和生理生化指標(biāo)的影響不同［20-21］，石榴細(xì)胞內(nèi)鈉和氯離子含量增加，會(huì)影響其他營養(yǎng)元素如氮、磷、鉀、鈣、鎂等的吸收，從而引起營養(yǎng)缺失［22-23］。BHANTANA等［24］認(rèn)為：石榴可以作為多年生落葉果樹的模式植物，研究其對逆境的響應(yīng)機(jī)制具有重要的意義。對石榴耐鹽性的研究主要集中在離子平衡和生長方面［3，20］，還沒有全面系統(tǒng)的闡述其抗鹽機(jī)理的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)選擇 ‘泰山紅’ ‘Taishanhong’， ‘超大籽’ ‘Chaodazi’和 ‘紅珍珠’ ‘Hongzhenzhu’3個(gè)適應(yīng)性廣，研究和推廣價(jià)值高，但抗逆性和適應(yīng)環(huán)境有所差異的優(yōu)良石榴品種［15］作為試材。通過研究不同品種對鹽脅迫的生理生化應(yīng)答，篩選耐鹽性指標(biāo)，以期為將來在鹽堿地石榴栽培和理論研究作參考。

1 材料與方法

1.1 材料

盆栽實(shí)驗(yàn)在南京林業(yè)大學(xué)的人工氣候室進(jìn)行。選擇 ‘泰山紅’ ‘超大籽’和 ‘紅珍珠’3個(gè)品種1年生扦插苗，2016年3月1日扦插于盆（32 cm×25 cm）中， 2株·盆-1，盆土基質(zhì)為V（珍珠巖）∶V（草炭土）=1∶1。設(shè)置人工氣候室溫度28/25℃（白/夜），光照周期14/10 h（光/暗），空氣濕度 75%，隔3 d澆1次水，隔1周澆1次Hoagland營養(yǎng)液［25］。石榴各品種生物學(xué)性狀如表1。

表1 各品種性狀對比［15］Table 1 Comparison of the traits of each pomegranate

1.2 方法

2017年4月1日選擇健壯并生長一致的石榴苗，用含不同氯化鈉濃度［0（ck），150，300，450 mmol·L-1］的1/2 Hogland營養(yǎng)液處理，重復(fù)3次·處理-1，各重復(fù)5盆，2株·盆-1。隔3 d的上午 10:00澆1次營養(yǎng)液（滲出的水分回澆），隔 6 d用淡水沖洗土壤（洗凈殘留的鹽分，防治鹽分累積）。處理 18 d后觀察植株生長情況，并采集位于植株中上部的功能葉片10～15片，放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱待測。將各處理的實(shí)驗(yàn)材料按照根、莖、葉分別收集，用水沖洗干凈，晾干，帶回實(shí)驗(yàn)室待用。

1.3 指標(biāo)測定

樣品根、莖、葉在105℃烘箱中殺青15 min，70℃烘干48 h至恒量。分別稱量，計(jì)算單株生物量與根冠比。葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定用丙酮浸提法［26］；丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸（TBA）法［27］；脯氨酸（Proline）采用酸性茚三酮比色法［28］； 可溶性蛋白質(zhì)（soluble protein）采用考馬斯亮藍(lán) G-250 比色法［29］； 超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍(lán)四唑 NBT光化還原［30］；過氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚法［31］；過氧化氫酶（CAT）采用紫外吸收法［32］；葉片鉀、鈉離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)經(jīng)微波消煮后，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定［33］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)由3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)獲得，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。Excel預(yù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后，用SPSS 19.0進(jìn)行 ANOVA分析（P＜0.05）和 Duncan多重比較（P＜0.05），用 Excel 2013作圖。運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)分析對不同耐鹽指標(biāo)進(jìn)行篩選和排序。根據(jù)于潔等［34］的方法計(jì)算 3個(gè)石榴品種的綜合評價(jià)值（D），按照楊升等［35］方法，將3個(gè)品種的耐鹽綜合評價(jià)值及12個(gè)指標(biāo)視為一個(gè)整體，計(jì)算各指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對石榴生長的影響

石榴3個(gè)品種的鹽害率和鹽害指數(shù)均隨著鹽濃度的增大而增大（圖1A，圖1B）。氯化鈉濃度為300 mmol·L－1時(shí)，各品種的鹽害率均接近 100%，鹽害指數(shù)均顯著增大（P＜0.05），表現(xiàn)為 ‘紅珍珠’＞ ‘超大籽’＞ ‘泰山紅’?？梢?， ‘泰山紅’耐鹽性更強(qiáng)。與對照組相比，低鹽濃度（150 mmol·L－1）下， ‘泰山紅’和 ‘超大籽’的單株生物量分別增長了21%和18%（P＜0.05），而 ‘紅珍珠’的生長卻受到抑制；隨著濃度升高，各品種生物量顯著下降（圖1C），說明高鹽脅迫抑制了石榴的生長。根冠比隨著鹽濃度的增大而增大（圖1D），由于脅迫時(shí)間短，其數(shù)值的變化主要是由地上部分生物量的下降導(dǎo)致。

圖1 鹽脅迫下3個(gè)石榴品種的鹽害率、鹽害指數(shù)、單株生物量和根冠比變化Figure 1 Variasions of salt injury rate,salt injury index,biomass per plant and root cap ratio of each pomegranate cultivars under NaCl stress

2.2 鹽脅迫對石榴葉片葉綠素，丙二醛（MDA），脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)的影響

隨著鹽濃度增大，單位質(zhì)量石榴葉片中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著下降（圖 2A）；與對照組相比，450 mmol·L－1鹽處理后， ‘泰山紅’ ‘超大籽’ ‘紅珍珠’葉片中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降了59.6%，58.8%和78.7%（P＜0.05），說明鹽脅迫對 ‘紅珍珠’葉片的葉綠素影響較大。丙二醛（MDA）是膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其質(zhì)量摩爾濃度越高，說明膜質(zhì)氧化程度越大，受到的鹽害也越重。研究發(fā)現(xiàn)：150 mmol·L－1氯化鈉處理下，單位質(zhì)量石榴葉片鮮樣中MDA質(zhì)量摩爾濃度升高，但品種間差異不顯著；鹽濃度達(dá)450 mmol·L－1時(shí)， ‘泰山紅’ ‘超大籽’ ‘紅珍珠’葉片中 MDA摩爾質(zhì)量濃度分別比對照組升高了 0.5，1.1和 1.9倍（P＜0.05）（圖 2B）。脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)參與調(diào)解滲透脅迫的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)：隨著氯化鈉濃度的增大，3個(gè)石榴品種單位質(zhì)量葉片中脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均升高（圖 2C），300 mmol·L－1時(shí)均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；葉片可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著鹽濃度的增大呈先降后升的趨勢， ‘泰山紅’和 ‘超大籽’的最低值在150 mmol·L－1處， ‘紅珍珠’的最小值在300 mmol·L－1處（圖 2D）。

圖2 鹽脅迫下3個(gè)石榴品種的葉綠素、丙二醛、脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)的變化Figure 2 Variasions of total chlorophyll,MDA,proline and soluble protein of each pomegranate cultivars under NaCl stress

2.3 鹽脅迫對石榴葉片抗氧化酶活性的影響

圖3 鹽脅迫下3個(gè)石榴品種葉片中氧化酶活性的變化Figure 3 Variasions of SOD,CAT,POD activities in each pomegranate cultivars leaves under NaCl stress

鹽脅迫對石榴葉片內(nèi)的抗氧化酶也有影響。隨著鹽濃度的升高，超氧化歧化酶（SOD）的活性先增大后減小 （圖 3A），與對照組相比， ‘泰山紅’和 ‘超大籽’的最大值出現(xiàn)在300 mmol·L－1處，且達(dá)到顯著水平（P＜0.05）； ‘紅珍珠’ 的最大值在 150 mmol·L－1處。 高鹽脅迫（450 mmol·L－1）下 ‘紅珍珠’ 的SOD酶活性大大降低。 ‘泰山紅’和 ‘紅珍珠’葉片中的過氧化氫酶（CAT）的活性隨著鹽濃度的升高先增大后減小，最大值在 300 mmol·L-1處；而 ‘超大籽’CAT酶活性隨著鹽濃度的增大而增大（圖 3B）。3個(gè)石榴品種葉片中過氧化物酶（POD）的活性隨著氯化鈉濃度的增大而升高，300 mmol·L-1時(shí)均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）（圖 3C）。

2.4 鹽脅迫對石榴葉片離子及比值的影響

鹽脅迫下，鈉離子在石榴葉片中迅速積累；隨著氯化鈉濃度升高，3個(gè)石榴品種單位質(zhì)量葉片中鈉離子分別比對照增加了 22.3～37.3，14.6～26.3和 12.6～23.6倍（圖 4A），差異顯著（P＜0.05）；各品種葉片中鈉離子的累積量排序?yàn)?‘泰山紅’＞ ‘超大籽’＞ ‘紅珍珠’。3個(gè)石榴品種單位質(zhì)量葉片中鉀離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨著氯化鈉濃度增大呈先上升后下降的趨勢，并在 300 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值（圖 4B），差異顯著（P＜0.05）；各品種葉片中鉀離子的累積量排序?yàn)?‘泰山紅’＞ ‘紅珍珠’＞ ‘超大籽’；相比對照組，300 mmol·L-1氯化鈉處理下，各品種葉片中鉀離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加了55.4%，46.2%和42.8%。可見，鹽脅迫下， ‘泰山紅’葉片吸收和積累較多的鈉鉀離子， ‘超大籽’次之， ‘紅珍珠’最小。各石榴品種葉片的鉀鈉離子比在鹽脅迫下顯著下降（圖4C），各處理之間差異不顯著，當(dāng)氯化鈉濃度不超過 300 mmol·L-1時(shí)，鉀鈉離子比均大于1，說明石榴在中度鹽脅迫下仍能夠保持一定的離子平衡。

圖4 鹽脅迫下3個(gè)石榴品種葉片中的鈉離子、鉀離子變化Figure 4 Variations of Na+,K+,K+/Na+ratio in each pomegranate cultivars leaves under NaCl stress

2.5 灰色關(guān)聯(lián)分析法篩選耐鹽指標(biāo)

計(jì)算可知：各石榴品種的耐鹽性與各指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)度為0.409～0.828（表2），其中關(guān)聯(lián)度最大的是生物量，其次為葉片中鈉離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別為0.828和0.652。各指標(biāo)按關(guān)聯(lián)度從大到小排序前 7個(gè)為生物量＞鈉離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞SOD活性＞鹽害指數(shù)＞鉀鈉離子比＞鉀離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞MDA質(zhì)量摩爾濃度。由于鉀鈉離子比這一指標(biāo)的變化包含了鈉離子和鉀離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，因此篩選出單株生物量、SOD酶活性、鹽害指數(shù)、鉀鈉離子比值和MDA質(zhì)量摩爾濃度等5個(gè)指標(biāo)，來評價(jià)石榴在鹽脅迫環(huán)境下的生長情況、膜系統(tǒng)穩(wěn)定性、滲透調(diào)節(jié)能力和離子平衡能力等。

表2 各指標(biāo)的關(guān)聯(lián)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度及序位Table 2 Grey correlation coefficient,value and sequence of different traits

3 結(jié)論與討論

3.1 鹽脅迫對石榴生長及生理生化指標(biāo)的影響

鹽漬環(huán)境下，植物的生物量和鹽害特征是反映植物耐鹽性大小的最直觀表型。有研究表明：鹽脅迫對植物的生長有抑制作用［4］；也有人認(rèn)為：雖然高鹽對植物有害，但低鈉對植物生長也會(huì)有促進(jìn)作用，這可能是因?yàn)殁c是植物生長的必需元素［36-37］。研究表明：石榴的一些品種如 ‘Manfalouty’ ‘Wonderfull’和 ‘Nab-Elgamal’在鹽脅迫下苗高、地徑、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量等都顯著下降［21，38］；而另一些品種如‘MalasShirin’ ‘Voshike-e-Saravan’ 和 ‘Tab-o-Larz’ 在低鹽脅迫下則生長良好［21，39］。 本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)： 與對照相比，鹽脅迫抑制了 ‘紅珍珠’的生長，但在 150 mmol·L-1氯化鈉處理下， ‘泰山紅’和 ‘超大籽’的生物量有所增加（圖1C），說明不同石榴品種耐鹽性存在差異。本研究還發(fā)現(xiàn)：隨鹽脅迫程度增加，單位質(zhì)量石榴葉片脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)、鉀離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，SOD，CAT和POD活性提高，起到緩解鹽害和防御活性氧傷害的作用［40］；但當(dāng)氯化鈉濃度超過 300 mmol·L-1時(shí)，鉀鈉離子比小于1，鉀離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)和 SOD，CAT活性均開始下降（圖3A，圖3B）。該研究結(jié)果說明石榴具有一定的耐鹽性， 能夠抵抗中度（300 mmol·L-1）的鹽脅迫， 與前人的研究結(jié)果一致［18，41］。

3.2 石榴耐鹽性指標(biāo)的篩選

植物耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過程。鹽漬環(huán)境下，植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化等各方面都可能發(fā)生變化。本研究利用灰色關(guān)聯(lián)分析法對12個(gè)耐鹽性指標(biāo)進(jìn)行了篩選，結(jié)果篩選出單株生物量、鈉離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)、SOD活性、鹽害指數(shù)、鉀鈉離子比值、鉀離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)和丙二醛質(zhì)量摩爾濃度等7個(gè)指標(biāo)。對石榴的耐鹽性評價(jià)反應(yīng)出石榴在鹽脅迫環(huán)境下的生長情況、膜系統(tǒng)穩(wěn)定性、滲透調(diào)節(jié)能力和離子平衡能力。SOD是重要的抗氧化酶之一，能夠減輕膜系統(tǒng)的氧化損傷［42］，而MDA是植物膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其質(zhì)量摩爾濃度的大小能夠衡量植物膜質(zhì)過氧化程度［43］。本研究發(fā)現(xiàn)：隨著氯化鈉濃度的升高，MDA質(zhì)量摩爾濃度上升，石榴膜質(zhì)過氧化程度加重，與楊升等［35］研究結(jié)果一致。鹽漬環(huán)境下，鈉離子是植物內(nèi)主要的毒害離子之一，鉀離子在植物的蛋白質(zhì)合成、光合作用、細(xì)胞滲透壓平衡和酶激活反應(yīng)等方面起著重要作用［44］。高鹽脅迫破壞植物細(xì)胞乃至整個(gè)植物體的鈉離子和鉀離子穩(wěn)態(tài)的失衡。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著氯化鈉濃度的增加，石榴葉片中鈉離子大量積累，是鹽害加重的主要原因。當(dāng)鹽濃度不超過300 mmol·L-1時(shí)，鉀離子作為無機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，有利于緩解鈉離子毒害，建立離子平衡穩(wěn)態(tài)和維持合理的鉀鈉離子比值。許多研究證明：鉀鈉離子比是衡量植物的抗鹽能力大小的重要指標(biāo)之一［4,45-47］。因此，篩選出單株生物量、SOD活性、鹽害指數(shù)、鉀鈉離子比值和 MDA質(zhì)量摩爾濃度5個(gè)形態(tài)和生理生化指標(biāo)，對評價(jià)這3個(gè)石榴品種的耐鹽性是比較科學(xué)合理的。

本研究對形態(tài)和生理生化指標(biāo)的綜合研究發(fā)現(xiàn)，石榴能夠承受的氯化鈉濃度不超過 300 mmol·L-1，且用生長量、鹽害特征以及離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)等指標(biāo)判斷其耐鹽性大小，具有理論和實(shí)踐的指導(dǎo)意義。本研究只選擇了3個(gè)石榴品種，要全面系統(tǒng)的研究石榴的耐鹽性，篩選耐鹽評價(jià)指標(biāo)并建立評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系還需要不斷深入探索。

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