上海地區(qū)幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥的相關(guān)基因檢測

黃聲雷， 郭 瑋， 胡必杰， 周春妹， 潘柏申

幽門螺桿菌（Hp）對克拉霉素耐藥是由于該菌的23S rRNA基因發(fā)生了某個位點(diǎn)突變導(dǎo)致了核糖體構(gòu)象改變，使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素結(jié)合位點(diǎn)也隨之發(fā)生改變，從而干擾了克拉霉素與細(xì)菌結(jié)合而產(chǎn)生耐藥。1996年Stone等[1]發(fā)現(xiàn)并報道了Hp對克拉霉素耐藥的分子基礎(chǔ)主要是23S rRNA基因中2143位點(diǎn)上A突變?yōu)镚。在我國Hp 23S rRNA基因2143單位點(diǎn)的突變是導(dǎo)致對克拉霉素耐藥的主要原因。2001年研究顯示北京地區(qū)耐克拉霉素的Hp 23S rRNA基因A2143G突變率高達(dá)100%[2]，2008年淮南地區(qū)耐藥Hp A2143G的突變率也高達(dá)100%[3]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，常用PCR方法如PCR限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)、熒光PCR原位雜交、23S rRNA基因組測序等被推薦用于檢測Hp的耐藥性。為了了解上海地區(qū)耐克拉霉素Hp的23S rRNA基因突變情況，同時為了提高樣本Hp檢測的陽性率，本研究使用兩種不同PCR方法，包括測序方法和熒光PCR熔解曲線法，直接對快速尿素酶試驗(yàn)篩查Hp陽性患者的胃黏膜組織標(biāo)本進(jìn)行Hp耐藥基因的檢測，評估兩種檢測方法結(jié)果的一致性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 2017年9-12月因上消化道癥狀于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受胃鏡檢查患者，選取快速尿素酶試驗(yàn)Hp陽性患者的尿素酶試管中廢棄的胃黏膜組織標(biāo)本80份。

1.1.2 主要試驗(yàn)材料 自動化樣品研磨勻漿器和無菌去熱源鋼珠（TissueLyserⅡ） 購自德國QIAGEN公司，商品化自動核酸提純及熒光PCR分析儀TCG-D1型由踏石生物科技蘇州有限公司提供；配套商品化試劑盒包括聚合酶試劑（KOD Mix）；引物HPC-F5'-GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCC-3，HPCR5'-GGCTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3'；熒光探針序列：5'-CAAGACGGAAAGACCC-3'；氟硼二吡咯熒光染料 （HPC Mix）；樣本稀釋液（含1%磷酸緩沖液和99%無菌水）；樣本萃取液（含1%pH調(diào)整劑的無菌水溶液），商品化試劑盒由踏石生物科技蘇州有限公司提供；DNAiso試劑盒和Ex Taq DNA聚合酶購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 將胃黏膜組織標(biāo)本放入含有0.9%NaCl溶液1.5 mL平底無菌離心管中，向管內(nèi)放入無菌去熱源直徑為0.2 cm鋼珠，將離心管固定在自動化樣品研磨勻漿器，來回振蕩研磨。設(shè)置儀器參數(shù)為：震蕩頻率60次/min，時間15 min。取180 μL樣本稀釋液和200 μL胃黏膜組織勻漿移至0.5 mL無菌離心管中；12 000 r/min室溫離心5 min，棄上清液向含沉淀物的離心管中加入50 μL樣本萃取液，渦旋振蕩混勻5～6 s；將離心管放置于95 ℃恒溫孵育箱5 min備用。

1.2.2 全自動核酸提純及熒光PCR分析儀操作 根據(jù)廠家提供的商品化PCR儀配套分析軟件GENECUBE-TCGS操作說明，設(shè)置PCR擴(kuò)增反應(yīng)以及檢出參數(shù)如下：待機(jī)溫度 35 ℃，預(yù)變性94 ℃ 30 s，變性 97 ℃ 1 s，退火 60 ℃ 3 s，延伸63 ℃ 5 s，待機(jī)溫度 35 ℃（變性-延伸的循環(huán)次數(shù)均為50次）。檢出參數(shù)：94 ℃ 30 s，39 ℃ 30 s，40～75 ℃，溫度上升速度為0.09 ℃/s。

1.2.3 檢測結(jié)果判讀 熒光微分值≥10，且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在50～60 ℃，提示Hp菌群陽性及23S rRNA基因2142和2143位點(diǎn)無突變；熒光微分值≥10，且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42～50 ℃，提示Hp菌群陽性及23S rRNA基因2142或2143位點(diǎn)有突變；熒光微分值＜10，內(nèi)部質(zhì)控?zé)晒馕⒎种怠?.0，且其熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42～68 ℃，提示Hp菌群陰性。

1.2.4 DNA測序方法 直接檢測樣本Hp及耐藥基因，參考DNAiso試劑盒說明書抽取胃黏膜組織勻漿中的DNA，針對克拉霉素耐藥Hp基因23S rRNA的核酸序列設(shè)計用于PCR的引物，在NCBI中查找參考序列，使用軟件Primer Premier 3.0進(jìn)行設(shè)計引物（由深圳華大基因股份有限公司合成），Hp 23S rRNA 上游引物A2142+A2143-F，5'-TTACCAAAAACACAGCA-3'；Hp23S r R N A 下游引物A 2 1 4 2+A 2 1 4 3-R，5'-CTCCATAAGAGCCAAAG-3' PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系50 μL為：10×反應(yīng)緩沖液5 μL 、dNTP 4 μL、引物各1 μL、Ex Taq 0.25 μL、模板1 μL 和無菌雙蒸水37.75 μL。PCR反應(yīng)條件為： 96 ℃，預(yù)變性5 min；95 ℃，變性20 s； 52 ℃退火45 s；72 ℃延伸60 s， 共45個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化和測序，交由深圳華大基因股份有限公司完 成。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 將資料和結(jié)果使用Excel建立數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，使用卡方檢驗(yàn)分析不同年齡段、性別、病種類型對Hp 23S rRNA第2142或2143位點(diǎn)變異的影響，當(dāng)P＜0.05表示兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義?？偨Y(jié)兩種試驗(yàn)方法的定性檢測結(jié)果，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率，并對定性檢測結(jié)果進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種方法結(jié)果的一致性。Kappa值≥0.75表示兩者一致性較好[4]。

2 結(jié)果

2.1 基本資料

本研究中，提供80份胃黏膜組織的患者年齡17～83歲，平均（53.6±13.9）歲；其中男40例，女40例。檢測Hp陽性患者臨床診斷包括慢性淺表性胃炎35例、慢性萎縮性胃炎21例、慢性糜爛性胃炎4例、胃潰瘍6例、胃癌2例和胃黏膜息肉1 例。

2.2 熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)果

使用熒光PCR熔解曲線法對80份快速尿素酶試驗(yàn)Hp陽性患者的胃黏膜組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，共69份樣本Hp陽性，11份Hp陰性，陽性率為86.2%。在69份Hp陽性的標(biāo)本中24份標(biāo)本存在23S rRNA第2142或2143位點(diǎn)的變異（突變株），45份標(biāo)本未檢測到位點(diǎn)突變（野生株），突變率占34.8%。本次試驗(yàn)中男性患者組和女性患者組的Hp 23S rRNA第2142或2143位點(diǎn)突變率分別為29.4%（10/34）和40.0%（14/35），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.356）。

Hp陽性患者按年齡分為老年（≥60歲）和非老年（17～59歲）兩組。結(jié)果顯示老年組和非老年組的Hp 23S rRNA第2142或2143位點(diǎn)突變率分別為36.4%（8/22）和34.0%（16/47），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.850）。

Hp陽性患者按照不同消化道疾病分為慢性淺表性胃炎組35例、慢性萎縮性胃炎組25例（包括慢性萎縮性胃炎21例和慢性糜爛性胃炎4例）和潰瘍組9例（包括胃潰瘍6例、胃癌2例和胃黏膜息肉1例）。結(jié)果顯示淺表性胃炎組、萎縮性胃炎組和潰瘍組的Hp 23S rRNA第2142或2143位點(diǎn)突變率分別為34.3%（12/35）、36.0%（9/25）和33.3%（3/9），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.986）。

2.3 DNA測序結(jié)果

80份快速尿素酶試驗(yàn)Hp陽性患者的胃黏膜組織標(biāo)本使用DNA測序法共檢測64份Hp陽性，16份Hp陰性，陽性率為80.0%。在64份Hp陽性的標(biāo)本中23份標(biāo)本檢測到23S rDNA耐藥基因的突變，41份標(biāo)本沒有檢測到基因突變，突變率35.9%。23株Hp突變株均為單位點(diǎn)突變，其中2142位點(diǎn)突變率為0，2143位點(diǎn)突變率為100%，19株為2143位點(diǎn)GG突變型，4株為2143位點(diǎn)AG雜合型。Hp野生型、雜合型和突變型的DNA核苷酸序列檢測結(jié)果見表1。

表1 Hp野生型、雜合型和突變型的DNA核苷酸序列檢測結(jié)果Table 1 DNA nucleotide sequencing results in wild-type, heterozygous, and mutant H. pylori

2.4 兩種方法對Hp核酸的有效檢測一致性評價

兩種方法陽性符合率、陰性符合率和總符合率分別為100%、68.8%和92.5%，Kappa系數(shù)為0.779。

2.5 兩種方法對Hp耐藥基因突變的一致性評價

本實(shí)驗(yàn)使用兩種方法共同檢測64份陽性樣本Hp 23S rRNA第2142或2143位點(diǎn)突變。其中熒光PCR熔解曲線法檢測Hp耐藥基因突變株22例，野生株42例。DNA測序法檢測Hp耐藥基因突變株23例，野生株41例。陽性符合率、陰性符合率和總符合率分別為87.0%、95.1%和92.2%，Kappa系數(shù)為0.829。

3 討論

2017年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會發(fā)布的抗Hp感染共識中推薦使用經(jīng)典鉍劑四聯(lián)根治方案[5]。然而在實(shí)際應(yīng)用中，四環(huán)素和呋喃唑酮藥物不良反應(yīng)風(fēng)險較大且難以廣泛獲得；甲硝唑耐藥率高，于2017年被世界衛(wèi)生組織列為2B類致癌物，因此克拉霉素被廣泛推薦用于Hp根除治療的一線方案[6]。但隨著我國克拉霉素在抗感染等領(lǐng)域的廣泛使用，Hp對其敏感率逐年下降，這成為含克拉霉素根除治療方案失敗的重要原因。Sun等[7]研究結(jié)果顯示上海地區(qū)Hp對克拉霉素的耐藥率從2000年8.6%上升到2005年9.0%再上升到2009年20.7%。國內(nèi)另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示北京地區(qū)Hp對克拉霉素的耐藥率從2000年14.8%上升到2009年65.4%[8]。因此在選擇治療方案前，先檢測Hp是否對克拉霉素耐藥，對于提高Hp根除率具有重要作用。

近年來國內(nèi)外學(xué)者對Hp 23S rRNA耐藥基因的突變進(jìn)行大量研究發(fā)現(xiàn)，Hp對克拉霉素耐藥主要與2142和2143位點(diǎn)的核苷酸A突變成G有關(guān)，最常見的是A2143G占69.8%，其次是A2142G占11.7%和A2142C占2.6%[9]。李曉芳等[10]對2017年成都地區(qū)分離的24株耐克拉霉素的Hp研究顯示所有耐藥株都在23S rRNA基因功能V區(qū)發(fā)生了A2143G的突變，突變率為100%。孫婷等[11]對2017年浙江地區(qū)分離127株Hp進(jìn)行23S rRNA基因突變篩查結(jié)果顯示，主要突變?yōu)锳2143G，突變頻率42.5%（54/127）， 其次為A2142G基因型突變2.4%（3/127）。但是也有研究顯示Hp耐藥株的遺傳學(xué)特征存在明顯地域差異，因此獲得本地區(qū)Hp對克拉霉素耐藥性的結(jié)果，對于臨床選擇最佳的根除方法極為重要。

本實(shí)驗(yàn)采用的熒光PCR熔解曲線法是目前國內(nèi)首次采用KOD-DNA聚合酶用于PCR來進(jìn)行Hp檢測。KOD-DNA聚合酶來源于超嗜熱古菌（Thermococcus kodakaraensis），與目前市場上PCR反應(yīng)體系常用的Taq DNA聚合酶比較，其耐熱性是傳統(tǒng)Taq DNA聚合酶的7倍，合成速度是其2.5倍。使用KOD-DNA聚合酶可以在45 min內(nèi)完成整個PCR，大大縮短了目前傳統(tǒng)PCR方法所需要的4～6 h的檢測時間，極大提高了檢測效率。此外本實(shí)驗(yàn)還采用quenching-probe技術(shù)設(shè)計熒光探針，使探針序列縮短到16 bp左右，在68～70 ℃時就能與靶序列特異退火，更短的序列可降低堿基不匹配的概率，從而提高方法的靈敏度。

本實(shí)驗(yàn)通過熒光PCR熔解曲線法和DNA測序法對臨床組織標(biāo)本直接檢測Hp對克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變，探尋兩種檢測方法對耐克拉霉素Hp之間的符合率，采用熒光PCR熔解曲線法直接對80份胃黏膜組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，其中69份樣本Hp陽性，陽性為86.2%。在69份Hp陽性的標(biāo)本中24例標(biāo)本存在23S rRNA第2142或2143位點(diǎn)的突變，突變率為34.8%。使用DNA測序方法對23株Hp突變株進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測，其中2142位點(diǎn)突變率為0，2143位點(diǎn)突變率為100%，19株為2143位點(diǎn)GG突變型，4株為2143位點(diǎn)AG雜合型，這與梁曉等[12]報道的上海地區(qū)Hp克拉霉素耐藥株主要以A2143G突變?yōu)橹鳎?7.1%）結(jié)果一致。以DNA測序法與熒光PCR熔解曲線方法對于Hp特異性序列檢測結(jié)果的一致性（Kappa）為0.779，兩者一致性較好；對于Hp23S rRNA第2142或2143位點(diǎn)突變檢測結(jié)果的一致性（Kappa）為0.829，兩者一致性較 好。

綜上所述，上海地區(qū)克拉霉素耐藥Hp菌株基因型以23S rRNA基因的A2143G突變占主導(dǎo)地位，23S rRNA點(diǎn)突變的檢測可以為臨床分析Hp對克拉霉素的耐藥性提供重要的參考依據(jù)。熒光PCR熔解曲線法可直接檢測胃黏膜活檢組織中Hp及其23S rRNA突變基因，該方法耗時短且結(jié)果可靠，為臨床快速、簡便的檢測Hp對克拉霉素耐藥性提供一種行之有效的解決方案。