枸杞黃酮的研究進展

吳霞明

(甘肅省食品檢驗研究院，蘭州 730030)

枸杞子具有滋肝潤肺、益精明目、強健筋骨等功效。據(jù)中醫(yī)記載，枸杞果實主治眩暈耳鳴、虛勞精虧、陽痿遺精、內(nèi)熱消渴、目昏不明、腰膝酸痛等癥狀[1-2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，枸杞果實富含黃酮、多糖、色素、脂肪酸、揮發(fā)油、維生素、酚酸、甜菜堿、微量元素等多種成分[3]。隨著對枸杞各種活性成分的不斷研究，作為主要活性之一的枸杞黃酮也逐漸系統(tǒng)起來，其豐富多樣的藥理作用也慢慢被發(fā)現(xiàn)[3-9]。文章綜述了近年來關(guān)于枸杞黃酮的研究進展，為今后枸杞黃酮的開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 枸杞黃酮的藥理作用

枸杞黃酮的抗氧化作用不僅可以阻止細(xì)胞的退化、衰老，以及癌癥的發(fā)生，還能改善血液循環(huán)，降低膽固醇。有些黃酮還含有PAF抗凝因子，對心腦血管疾病的抑制和改善有很大作用[3-10]。

1.1 抗氧化活性

1.2 抗腫瘤活性

黃元慶等[11]發(fā)現(xiàn)，枸杞黃酮對正常細(xì)胞的熱能代謝有促進作用，而對小鼠L1210癌細(xì)胞的熱能代謝有抑制作用，在枸杞黃酮濃度為4.1g /L時，對產(chǎn)熱抑制率最大為44%。雷蕾等[12]利用體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG2為研究對象，發(fā)現(xiàn)枸杞黃酮作用于HepG2時，可明顯抑制HepG2的增殖，且在作用時間和劑量方面呈現(xiàn)出顯著的依賴性。此外，隨著作用時間的延長，枸杞黃酮在作用一定時間時，可促進HepG2中Bax和Caspase-3的表達，這2種蛋白正是促進HepG2促凋亡的蛋白。所以，枸杞黃酮抗腫瘤活性的作用機制為抑制腫瘤細(xì)胞增殖或者是誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，在有效上調(diào)促凋亡蛋白表達的同時還會破壞癌細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境，繼而再激活主導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的蛋白表達，最終引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。

1.3 調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)

為了研究枸杞黃酮對良性前列腺增生大鼠血清性激素的影響，楊麗等[13]建立模型，研究不同濃度的枸杞黃酮對前列腺重量、臟器系數(shù)、前列腺體積、睪酮濃度、雌二醇濃度、性激素結(jié)合球蛋白指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示，240 mg/kg的枸杞黃酮就能讓前列腺增生大鼠的前列腺體積減小，因為枸杞黃酮可以調(diào)節(jié)激素水平從而抑制前列腺增生。由此說明，枸杞黃酮對良性前列腺增生有明顯的抑制作用。

1.4 其他藥理作用

廖國玲等[14]以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究對象，建立H2O2誘導(dǎo)HUVEC的氧化損傷模型，來研究枸杞黃酮對氧化損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的一氧化氮和一氧化氮合酶的相互作用，表明枸杞黃酮對H2O2損傷的人血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護作用，且保護效果與枸杞黃酮呈一定的劑量依賴性。此外，還有研究揭示了枸杞黃酮的抗炎機理，因為腫瘤壞死因子(TNF-α)會激發(fā)細(xì)胞中炎癥因子的表達，但是枸杞黃酮可以抑制炎癥因子比如細(xì)胞黏附分子的表達，從而發(fā)揮良好的抗炎作用[9-16]。天然的枸杞黃酮類化合物多以苷類形式存在，由于黃酮與糖之間鍵合時因為各自種類、數(shù)量、鍵合位置及方式的不同，從而能形成功能多樣、種類繁多的黃酮苷類，所以關(guān)于枸杞黃酮的鍵合機理及藥理作用等方面還有很多研究空間。

2 枸杞黃酮提取技術(shù)的研究進展

目前報道的從枸杞中分離制備的黃酮類化合物主要有5種[17-18]，包括金合歡素、木犀草素、金合歡素-7-0-α-L-鼠李糖基(1→6)-β-D-葡萄糖苷、5，7，3’-三羥基-6，4’，5’三甲氧基黃酮、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖基(1→6)-β-D-葡萄糖苷等。枸杞中黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)種類復(fù)雜多變，既有水溶性的黃酮苷，又有醇溶性的黃酮苷元，以及伴生的復(fù)雜體系中其他化合物，所以篩選出優(yōu)質(zhì)高效環(huán)保的提取方法是枸杞黃酮應(yīng)用于實際生產(chǎn)中的研究重點。

2.1 有機溶劑提取法

溶劑提取法是提取有效成分的重要方法之一，具有操作簡單、設(shè)備要求不高等優(yōu)點。由于枸杞中黃酮類化合物既有水溶性的黃酮苷，又有醇溶性的黃酮苷元，同時再考慮到其他化學(xué)溶劑殘留而引發(fā)的安全性等綜合問題，工業(yè)上首選食品級、藥品級的乙醇作為枸杞黃酮的提取溶劑，而且，黃酮甙元類化合物適合用95%左右的高濃度醇提取，黃酮甙類化合物比較適合用65%左右的低濃度醇提取[19]。彭小敏[20]以總黃酮含量、蘆丁含量為評價指標(biāo)，利用L9(34)正交試驗，優(yōu)選出乙醇提取的最佳條件為料液比1∶30、提取溫度80℃、提取時間30 min、乙醇濃度80%，提取1次，枸杞中總黃酮含量在8 mg/g以上，蘆丁含量在0.7 mg/g以上。由于該方法的料液比和乙醇濃度都比較高，不僅加重溶劑回收負(fù)荷，而且大大增加生產(chǎn)成本，此外，提取溫度也相對較高，這也會影響枸杞黃酮的部分活性。韓秋菊[21]在研究枸杞黃酮的提取中以黃酮提取率為評價指標(biāo)，利用L9(34)正交試驗，確定了乙醇提取枸杞黃酮的最佳工藝為料液比1∶10、提取溫度80℃、提取時間4 h、乙醇濃度60%，提取率為17.1 mg/g。此方法相對之前的提取方法有所改進，但是依舊存在回收及生產(chǎn)成本方面的考慮因素，加之提取時間比較長和溫度較高，這樣不僅耗能較大，對所提取的枸杞黃酮的穩(wěn)定性及活性也有不利的影響。吳韶梅等[22]使用索氏回流的方法，以總黃酮含量為評價指標(biāo)，優(yōu)化的提取工藝條件為乙醇濃度70%、料液比1∶26、回流提取3.5 h、提取溫度87℃，得總黃酮含量為8.10 mg/g。相對而言，此方法料液比較大，而且提取時間較長，總黃酮得率也不是很理想，不利于枸杞黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)。

溶劑提取法雖然具有操作容易、設(shè)備簡單等優(yōu)點，但是隨著近幾年來其他提取技術(shù)的發(fā)展，這種傳統(tǒng)的提取方法所表現(xiàn)出的提取率低、提取物純度低、溶劑用量大、耗時費力等劣勢也就更加明顯。所以，在傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)上繼續(xù)創(chuàng)新改進就顯得尤為重要。

2.2 微波輔助提取法

近年來，微波輔助提取(MAE)因為其獨特性成為眾多提取技術(shù)中運用較多的一項新輔助提取技術(shù)。MAE的原理是同時利用偶極子旋轉(zhuǎn)和離子傳導(dǎo)里外結(jié)合的方式加熱萃取，所以微波萃取具有穿透力強、選擇性高、受熱均勻、節(jié)能省時、溶劑用量少、安全環(huán)保、提取有效成分質(zhì)量高等特點[23]，因而成為高效優(yōu)質(zhì)提取食品和中藥等有效成分的一項新技術(shù)。楊鵬等[24]以枸杞黃酮提取率為指標(biāo)，利用L16(45)正交試驗，優(yōu)選出MAE法提取枸杞黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度70%、料液比1∶16、微波提取溫度70℃、微波功率300 W、微波作用時間120 s，得總黃酮提取率為18.96 mg/g。此方法相比于有機溶劑提取法，不僅提高了提取率，還很大程度減少了提取時間，節(jié)能環(huán)保且高效。但是，微波提取產(chǎn)生的熱效應(yīng)，會在短時間內(nèi)使溶液溫度迅速增加，發(fā)生其他反應(yīng)。對枸杞黃酮的相對穩(wěn)定性及生物活性也有一定影響。張自萍等[25]以枸杞黃酮提取率為指標(biāo)，利用L9(34)正交試驗，確定微波輔助提取枸杞黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度80%、料液比1∶30、功率300 W、提取溫度100℃、提取時間20 min，枸杞黃酮提取率為10.5mg/g。相較而言，此方法料液比過大，提取溫度過高，微波處理時間相應(yīng)增長，對枸杞黃酮的純度、穩(wěn)定性、活性等可能產(chǎn)生一定的影響，從而導(dǎo)致枸杞黃酮的提取率相對較低。史高峰等[26]以枸杞黃酮浸膏及其浸膏中總黃酮的含量為指標(biāo)，利用單因素試驗和正交試驗(L9(34))，確定了提取枸杞黃酮的MAE法最佳工藝為96%工業(yè)乙醇、料液比1∶12、微波功率400 W、回流時間40 min。此法中枸杞黃酮浸膏得率達62.72 %、浸膏中總黃酮含量達2.69%、枸杞黃酮提取率為16.87 mg/g。此法雖然有所改進，但是離理想值還是有所差距。

微波輔助相比于傳統(tǒng)有機溶劑提取法，不僅節(jié)約用時、降低耗能，還提高了枸杞黃酮的提取率，但是微波的穿透力和對物質(zhì)產(chǎn)生由內(nèi)到外的震蕩熱效應(yīng)會讓提取溶液迅速升溫，從而加速溶劑蒸發(fā)，可能在這個過程中產(chǎn)生一些不利的反應(yīng)從而降低枸杞黃酮的整體利用率[27]。因此，尋找更為高效的提取方法是研究重點。

2.3 超聲波輔助提取

超聲波輔助提取也是近年發(fā)展起來的一種輔助提取技術(shù)。劉敦華等[28]以枸杞黃酮得率為指標(biāo)，利用單因素試驗、響應(yīng)面法，優(yōu)化了超聲波提取枸杞黃酮的工藝條件為乙醇濃度60%、料液比1∶31、超聲溫度71℃、超聲時間42 min，枸杞黃酮提取率為10.7 mg/g。從中可以看出，超聲波輔助提取后，枸杞黃酮的整體提取效果有明顯的改善。但是，該方法中的提取劑濃度和料液比都比較高，這不僅需要大量的溶劑回收過程，也會大大使生產(chǎn)成本增加。另外，此方法的超聲溫度和超聲時間也相對較高，這也會影響枸杞黃酮的相對穩(wěn)定性和活性。吳韶梅[22]以總黃酮含量為指標(biāo)，通過L9(34)正交試驗，確定了超聲波提取枸杞黃酮的最佳條件為乙醇濃度50%、料液比1∶40、超聲時間60 min、提取溫度80℃，得枸杞總黃酮含量為9.38 mg/g。此法跟前面的方法相比，提取劑的濃度有所減小，但是料液比、提取溫度、提取時間都較高，這些條件均對枸杞黃酮的含量及活性有影響，依舊達不到理想狀態(tài)。韓秋菊等[21]在對比3種提取枸杞黃酮的方法中，以枸杞黃酮提取率為指標(biāo)，利用L9(34)正交試驗，確定超聲輔助提取枸杞黃酮效果最好條件為乙醇濃度80%、料液比1∶30、超聲功率80 W、超聲時間15 min，其提取率為18.4 mg/g。此法不僅較明顯地提高了提取率，而且在提取時間方面也占有一定的優(yōu)勢。

超聲波萃取的原理就是利用超聲空穴來破壞提取物的細(xì)胞壁，同時增加溶劑的穿透力來優(yōu)化提取時間和提取效率，從而高效、快速地使提取物的細(xì)胞內(nèi)容物溶解于提取溶劑中[29-30]，對提取物的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生的不利影響也會大大降低。此外，超聲波輔助萃取的有效成分雜質(zhì)含量比較少所以易于純化分離，而且其操作便捷[30]，綜合經(jīng)濟效益顯著。雖然通過超聲輔助枸杞黃酮的提取率有所增加，但其溶劑量依舊過多，還是增加了溶劑的回收成本，而且整個過程中各種因素結(jié)合影響枸杞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和活性，依舊不利于工業(yè)化的生產(chǎn)[31]。

2.4 酶催化提取法

酶的高效催化技術(shù)近年來備受各行各業(yè)的關(guān)注，這一技術(shù)也被應(yīng)用于枸杞黃酮的提取中，韓愛霞等[32]利用單因素試驗，以枸杞總黃酮提取率為指標(biāo)，采用酶催化法的最佳工藝為乙醇濃度40%、果膠酶濃度0.02 g/L、酶解pH 3.5、酶解溫度40℃、酶解時間1.5 h，得總黃酮提取率為10.6 mg/g。水果加工中常用果膠酶來處理破碎果實，因為果膠酶能破壞細(xì)胞壁，從而加速果汁的出汁率[33]，同時還能提高汁液的過濾速度，增加汁液的澄清度和質(zhì)感等。近幾年，應(yīng)用酶催化提取枸杞黃酮的相關(guān)研究也有所進展，相比于乙醇提取，酶催化提取的黃酮得率相對要高，但是，從酶的種類選擇、含量控制、影響因素篩選等方面都還不夠成熟，還需要繼續(xù)不斷改進和研究才能走向工業(yè)化生產(chǎn)。

2.5 磁場強化萃取法

周蕓等[34]以枸杞果漿中黃酮提取率為指標(biāo)，利用正交試驗L14(45)，確定磁場強化萃取枸杞黃酮的工藝條件為640 mT的磁感應(yīng)強度、40 min的磁化時間、65℃的磁化溫度、60 min的浸提回流時間，此法使枸杞黃酮的提取率達到了2.91 mg/g。磁場強化萃取技術(shù)被稱為“綠色分離技術(shù)”，是因為這種技術(shù)借助的是外加磁場來達到強化分離的過程，不僅可以利用磁場產(chǎn)生的特殊能量來改變抗磁性物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)，從而使其理化性質(zhì)發(fā)生變化，而且還能同時促進反應(yīng)速率達到強化萃取、離子交換、吸附、絮凝等過程[19，34-35]。雖然這一技術(shù)在其他領(lǐng)域運用較廣泛成熟，但是對于枸杞黃酮的萃取而言依舊需要加強研究。

2.6 MAR純化法

大孔吸附樹脂(MAR)因為其自身球狀、多孔的特殊性能常被當(dāng)做吸附分離的高分子材料[19]。有人通過樹脂性質(zhì)、靜態(tài)吸附、解吸附、動態(tài)吸附實驗，從AB-8、D-101、X-5、NKA和ADS-7篩選最優(yōu)樹脂為D-101，60%乙醇為最優(yōu)洗脫劑。并將枸杞黃酮含量從5.8mg/g提高到107.7mg/g。此方法操作簡便、經(jīng)濟、純化效率高，適合工業(yè)化推廣[36-37]。賈韶千等[38]以枸杞黃酮含量為指標(biāo)，采用靜態(tài)吸附、解吸附實驗，從AB-8、D101、HPD-100、HPD-600中優(yōu)選了HPD-100為最優(yōu)樹脂，并通過動態(tài)吸附實驗，確定了最優(yōu)條件為上樣濃度5.0 mg/mL、上樣流速2.0 mL/min、洗脫液為50%乙醇溶液、洗脫速度1.5 mL/min，其枸杞總黃酮的純度為785.3 mg/g，回收率為71.35%。此方法操作簡單、經(jīng)濟，對枸杞黃酮吸附量大、純化效果好、回收率較高，有著很好的應(yīng)用前景。許亮等[39]以枸杞黃酮含量為指標(biāo)，分析了各樹脂(AB-8、NKA-9、XDA-1、HDP-100、HDP-600、S-8)的特點，選擇了XDA-1為吸附枸杞黃酮用的最佳樹脂，采用L9(34)正交試驗，確定了枸杞黃酮吸附、洗脫條件為上樣濃度0.25 mg/mL、流速0.5 mL/min、樣品pH 5.0、洗脫溶劑為80%乙醇溶液、洗脫液用量5 BV，得枸杞黃酮含量為798 mg/mL，回收率為87.4%。影響樹脂吸附的因素很多，主要有被分離成分的極性和分子大小、溶劑對成分的溶解性、溶液濃度及吸附流速度等。隨著大孔樹脂純化分離技術(shù)的不斷研究，枸杞黃酮的分離篩選條件也在不斷改善。因為枸杞黃酮屬于弱極性物質(zhì)，所以要相對應(yīng)的選擇極性較弱的樹脂[36-40]，上述文獻中所選樹脂都是弱極性或非極性樹脂。此外，吸附和解吸附條件的選擇直接影響著分離純化工藝的好壞。

2.7 液相色譜純化分析法

液相色譜技術(shù)具有高速、高效、高靈敏度的特點，但是由于其分離純化效率太低，分離條件不易控制，此項技術(shù)還未廣泛應(yīng)用于分離純化。董靜洲等[41]建立了針對枸杞黃酮提取液進行色譜柱分離的條件：流動相A：1.0%乙酸；流動相B：甲醇；流速：1.0 mL/min黃酮。流動相(B)程序：0.00 min(0.1%)→ 10 min(0.5%)→ 30 min(95.0%)→ 50 min(0.1%)。并判斷其為異黃酮。雖然目前的分離純化技術(shù)有很多，但由于枸杞黃酮結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)的特殊原因，其分離純化的方法還需要不斷創(chuàng)新和探索。

綜上所述，枸杞黃酮的提取純化技術(shù)也在不斷創(chuàng)新、不斷改進，其研究還大有空間。但是，不管是傳統(tǒng)的有機溶劑提取，還是微波、超聲波輔助提取或是運用新的酶解技術(shù)還是磁場萃取技術(shù)，都存在或多或少不理想因素，所以在枸杞黃酮提取技術(shù)的研究道路上依舊需要不斷探索，而且所有研究的目的都是為了尋找高效、節(jié)能、環(huán)保的提取技術(shù)并為工業(yè)化生產(chǎn)提供產(chǎn)品質(zhì)量保證的方法。

3 枸杞黃酮的展望

枸杞黃酮作為枸杞果實中開發(fā)潛能極高的一種資源性物質(zhì)，不僅應(yīng)用于功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，還可以滿足其他行業(yè)領(lǐng)域的市場需求，食品行業(yè)中作為天然添加劑，如保鮮中的天然抗氧劑、增味劑中的天然甜味劑、食品色彩中的天然色素等；農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中枸杞黃酮類物質(zhì)被用于促進農(nóng)作物的生長、農(nóng)產(chǎn)品的增產(chǎn)，抑制細(xì)菌真菌類農(nóng)作物病害，對抗旱澇、低溫、干熱等自然災(zāi)害等；在化妝品行業(yè)中，天然的枸杞黃酮因為其抗氧化、清除自由基等功效能發(fā)揮皮膚美白、抗衰老、再生等作用[42-43]。雖然枸杞黃酮的應(yīng)用領(lǐng)域比較廣泛，但大部分相關(guān)聯(lián)的研究都僅徘徊于表型，而對于功能原理和活性機制方面的研究缺乏深度，因此，未來的研究若能針對枸杞黃酮的薄弱環(huán)節(jié)繼續(xù)深入，則對其醫(yī)藥臨床、食品保健、護膚化妝、綠色農(nóng)藥等市場可起到良好的指導(dǎo)作用[44]。同時，高效率、低能耗、高純度的枸杞黃酮的研究也是今后開發(fā)工作的重點，為構(gòu)建我國枸杞資源綠色循環(huán)和高效利用等綜合發(fā)展模式提供科學(xué)借鑒。◇