先天性青光眼患兒房水及血清皰疹病毒抗體檢測分析

馮麗麗 王曉蕾 王朱健 曹文俊 陳雪莉

原發(fā)性先天性青光眼(primary congenital glaucoma, PCG)又稱水眼、牛眼或發(fā)育性青光眼，是由于胚胎時期發(fā)育障礙，導(dǎo)致房角結(jié)構(gòu)先天性異?；蚍拷菤埩襞咛ソM織，阻礙房水正常排出，進(jìn)而眼壓升高和整個眼球不斷增大，以視神經(jīng)受到不可逆性損害為主要特征的一種疾病。因大多數(shù)降眼壓藥物均有不同程度的全身副作用，臨床上針對PCG的治療以手術(shù)控制眼壓為主[1]。關(guān)于其確切病因尚不清楚。近年來幾項研究顯示，在部分青光眼患者的房水中檢測到皰疹病毒(herpes virus)，并表明病毒感染在青光眼的發(fā)病機(jī)制中起到一定作用[2-3]。但對于PCG患者，母體的病毒感染，尤其是皰疹病毒感染是否在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，目前尚無明確結(jié)論。臨床上將受到皰疹病毒感染及未受到皰疹病毒感染的PCG患者區(qū)分開來是極為重要的。對于皰疹病毒感染的患者而言，如果降眼壓手術(shù)治療的同時聯(lián)合抗病毒藥物治療，可能會收到更好的治療效果。然而，目前判斷PCG患者是否伴有皰疹病毒感染的常用方法是采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測眼內(nèi)病毒的含量，但此方法不僅價格昂貴，而且房水樣本不易獲得，并非適用于所有患者。本研究目的在于結(jié)合PCR和相關(guān)病毒抗體生成2種方法檢測PCG患者的房水情況，結(jié)合血清抗體生成情況，進(jìn)而比較病毒陽性和病毒陰性PCG患者臨床特點的差異。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2011年1～12月在本科就診的PCG患兒13例，作為PCG組，其中男性9例、女性4例。診斷依據(jù)：嬰幼兒出現(xiàn)不明原因的畏光、流淚和眼瞼痙攣，進(jìn)行性眼球增大、眼軸增長，角膜水腫、混濁，伴/不伴后彈力層破裂，眼壓異常升高[>21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)]，視乳頭凹陷病理性擴(kuò)大(杯盤比>0.3)，房角結(jié)構(gòu)發(fā)育異常(中胚葉組織殘留小梁或房角膜樣組織生長等異常導(dǎo)致房水排出受阻)。詳細(xì)詢問所有患兒的病史及治療情況，并在基礎(chǔ)麻醉下，對患兒進(jìn)行詳細(xì)的眼部檢查，包括眼壓、角膜直徑、角膜形態(tài)、房角結(jié)構(gòu)及眼底檢查等，記錄一般資料。手術(shù)(均為首次手術(shù)眼)開始前抽取部分前房水及外周靜脈血進(jìn)行病毒相關(guān)檢測。選取同期年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者13例(13眼)作為房水對照組，所選患者均排除皰疹病毒感染病史，行白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)前抽取房水；選取與PCG患兒年齡及性別匹配的健康兒童50例作為血清對照組，所選兒童無PCG病史，排除主要系統(tǒng)性疾病，各器官、組織發(fā)育正常，具備有效抵御各種疾病的能力。所有樣本的獲取均由患者監(jiān)護(hù)人或患者本人簽署知情同意書。

根據(jù)13例PCG患兒的病毒感染情況分為2組，病毒陽性組：PCR結(jié)果及房水相關(guān)病毒IgG抗體生成結(jié)果，任一陽性；病毒陰性組：PCR結(jié)果及房水相關(guān)病毒IgG抗體生成結(jié)果，均為陰性。

1.2 房水及靜脈取材方法 臥位取材：患兒在全身麻醉下平臥于手術(shù)床，常規(guī)手術(shù)前結(jié)膜囊消毒、鋪巾。在手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行操作，開瞼器開瞼，一手拿顯微鑷子固定眼球，另一手用1 mL空針從角膜緣平行穿刺進(jìn)入前房，抽取房水0.1 mL，拔出針頭，前房水立即送檢。靜脈取材：患兒在全身麻醉下平臥于手術(shù)床，于股靜脈或肘靜脈抽取3 mL外周靜脈血。

1.3 病毒檢測方法

1.3.1 房水和血清相關(guān)病毒抗體的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(Virion/Serion，德國)檢測受試者房水中單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、水痘-帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus,VZV)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)的IgG抗體及血清相應(yīng)病毒的IgG及IgM抗體。檢測步驟依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作,酶標(biāo)儀型號為Tecan Sunrise(TECAN，瑞士)。房水檢測的吸光度(optical density，OD)值>正常對照組樣本的基準(zhǔn)值，即平均OD值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差(95%可信區(qū)間)為檢出；≤基準(zhǔn)值為未檢出。同時采用散射免疫比濁法(Nephstar,Goldsite Diagnostics, 中國)檢測房水及血清中的白蛋白濃度。房水中檢測出的病毒IgG抗體以房水/血清白蛋白比值進(jìn)行校正，校正比值的計算公式為：(房水病毒IgG/血清病毒IgG)/(房水白蛋白濃度/血清白蛋白濃度)。當(dāng)房水中檢出相關(guān)病毒IgG抗體，且房水/血清校正值>ROC曲線計算出的最佳臨界值時，可認(rèn)為有眼內(nèi)相關(guān)病毒IgG抗體產(chǎn)生。血清檢測的OD值>正常對照組樣本的基準(zhǔn)值，即平均OD值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差(95%可信區(qū)間)為檢出；≤基準(zhǔn)值為未檢出。

1.3.2 房水病毒DNA的檢測 采用DNA檢測試劑盒(FlexiGene DNA Kits,QIAGEN)從房水中提取病毒DNA，檢測具體步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用PG biotech人相關(guān)病毒(HHSV、HVZV、HCMV)核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒，使用實時PCR進(jìn)行相關(guān)病毒DNA檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 23.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。對PCG組與房水/血清對照組皰疹病毒感染情況的比較，用獨立樣本t檢驗；對皰疹病毒陽性組和陰性組間年齡、性別、眼別、房角結(jié)構(gòu)、Haab紋的比較，用Fisher精確檢驗；對皰疹病毒陽性組和陰性組間最高眼壓、杯盤比、角膜直徑的比較，用獨立樣本t檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCG組與房水/血清對照組的皰疹病毒及抗體檢測情況 房水/血清對照組的房水/血清相關(guān)病毒抗體均為陰性。PCG患者的皰疹病毒感染陽性率明顯高于對照組(表1)。

表1 PCG組與房水/血清對照組的皰疹病毒及抗體檢測情況

注：“-”表示無此項

2.2 PCG患者中病毒抗體陽性組和陰性組的臨床特征分析 PCG組中病毒抗體陽性組和陰性組分別為9例和4例。2組的平均年齡：陽性組為(10.2±18.9)個月，陰性組為(15.7±7.2)個月；單眼患?。弘p眼患病=7∶6；起病最高眼壓：陽性組為(27.4±10.7)mmHg，陰性組為(36.3±7.4)mmHg；角膜直徑：陽性組為(13.06±0.73)mm，陰性組為(12.83±0.58)mm；杯盤比：陽性組為0.83±0.11，陰性組為0.84±0.11；Haab紋所占比例：陽性組為88.9%，陰性組為75%。各項臨床指標(biāo)在2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

2.3 PCG患者房水病毒陽性組的臨床資料 在PCG患兒中，幾乎所有的患兒均存在下面一項以上檢查結(jié)果異常：眼壓增高、角膜直徑增大、房角虹膜根部附著點前移、中胚葉組織殘留、杯盤比明顯增大及出現(xiàn)Haab紋等。其中，房水病毒抗體陽性1例(CMV-IgG)，另1例CMV PCR陽性，此2例患者血清HSV IgG抗體檢測均為陽性。CMV-IgG陽性患兒右眼發(fā)病，最高眼壓52 mmHg，杯盤比1.0，角膜直徑13 mm，角膜水腫、混濁，房角結(jié)構(gòu)窺不清，具有明顯的Haab紋；另1例CMV PCR陽性患兒雙眼發(fā)病，最高眼壓25.8 mmHg,雙眼杯盤比均為0.8，角膜直徑13.5 mm，角膜水腫、混濁，房角結(jié)構(gòu)窺不清，未見Haab紋。

3 討論

皰疹病毒家族是一系列侵略細(xì)胞的微小有機(jī)體，可以分裂細(xì)胞的正?；顒?。感染人類的皰疹病毒有8種，包括HSV-1、HSV-2、VZV、EB病毒(EB virus， EBV)、CMV、人類皰疹病毒6型(HHV-6)、人類皰疹病毒7型(HHV-7)以及人類皰疹病毒8型(HHV-8)[4]。

大多數(shù)HSV-1感染發(fā)生在幼年，因絕大多數(shù)癥狀輕微或不明顯而完全被忽略，有癥狀者通常在嘴唇、鼻子等部位出現(xiàn)顏面部皰疹。有研究表明，美國14歲以上人群約有56%的人口感染過HSV-1[5]；我國及日本、泰國等亞洲國家HSV-1的人群感染率為50%～60%[6]。HSV-2感染通常造成生殖器皰疹。最新的研究數(shù)據(jù)表明美國HSV-2感染率高達(dá)25%；此外，全球人群HSV-2感染也十分廣泛：挪威24%、墨西哥40%、澳大利亞16%、瑞典20%，全球最高感染率為非洲撒哈拉南部女性的70%[6]。幾乎所有人在成年前都接觸過VZV，但絕大多數(shù)患者為隱性感染而無癥狀。有癥狀者通常在皮損愈合后，病毒潛伏于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，以后可再度活動導(dǎo)致身體單邊的疼痛性水皰皮損，通常發(fā)作于胸、背或面部[7-8]。

有關(guān)HSV和VZV感染型前部葡萄膜炎導(dǎo)致繼發(fā)性青光眼的研究中，47%～90%發(fā)生眼壓升高[9-11]，2%～54%發(fā)展為繼發(fā)性青光眼[9-10, 12-13]。關(guān)于HSV感染與青光眼的相關(guān)性，F(xiàn)alcon等[2]曾經(jīng)研究在英國Moorfields眼科醫(yī)院因感染HSV而出現(xiàn)高眼壓的50例患者，發(fā)現(xiàn)HSV反復(fù)感染后的數(shù)周～30年中，絕大部分患者出現(xiàn)了眼壓增高。沒有患者在首次出現(xiàn)病毒感染性眼部癥狀時出現(xiàn)眼壓升高。Hogan等[3]首次對具有絕對期青光眼和皰疹性角結(jié)膜炎尸眼標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在HSV感染的角結(jié)膜炎青光眼患者中，小梁網(wǎng)的阻塞和炎癥是眼壓增高的主要原因。炎癥細(xì)胞、纖維蛋白和血漿蛋白等的聚積導(dǎo)致小梁網(wǎng)的阻塞，而角膜后膜(retrocorneal membrane)的形成破壞了房角結(jié)構(gòu)。因炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致的增厚和水腫的小梁網(wǎng)也阻塞了房水的外流。虹膜后粘連導(dǎo)致瞳孔阻塞，從而進(jìn)一步發(fā)展為閉角型青光眼[3]。但是在Falcon等[2]研究的50例患者中，房角關(guān)閉并非是眼壓增高的根本原因。

關(guān)于CMV，全球感染率超過70%，我國人群感染率為95%。感染人群通常沒有癥狀，孕期感染CMV通常會對新生兒產(chǎn)生嚴(yán)重影響[14]。有研究表明，胎兒宮內(nèi)感染CMV，可導(dǎo)致視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、視神經(jīng)缺損以及角膜混濁等病變[15]; 在成人青光眼睫狀體炎綜合征患者中，感染CMV可能導(dǎo)致小梁網(wǎng)炎癥反應(yīng)以及繼發(fā)性青光眼發(fā)作[16]。

本研究中PCG患者按照臨床準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格入組，其中首次診斷時均進(jìn)行了角膜直徑、眼壓、房角結(jié)構(gòu)、杯盤比檢查，排除了先天性大角膜、產(chǎn)傷所致角膜混濁等疾病。另外，本次研究選取的多為需要手術(shù)治療的患者，均為多次就診，臨床資料較完整。在收集的所有PCG患者中，血清皰疹病毒IgG抗體的陽性率為69.2%。由于嬰兒自身免疫狀況尚不完善，且IgG相對分子質(zhì)量較小，可通過胎盤，故考慮此部分患兒母體感染病毒的可能性大。但由于本研究并未對患兒母親進(jìn)行相關(guān)的血清學(xué)檢查，故皰疹病毒感染可能來自于母體的結(jié)論僅限于猜測，需要更詳盡的檢測數(shù)據(jù)支持。

目前關(guān)于PCG的發(fā)病機(jī)制尚無定論，來源于母體的病毒感染或新生兒新發(fā)生的病毒感染，是否在PCG的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用尚無相關(guān)研究。鮮有報道研究皰疹病毒感染與PCG發(fā)病相關(guān)性。盡管由于樣本數(shù)量較少等原因并未證實病毒感染與PCG發(fā)病之間的確切相關(guān)性，但我們的結(jié)果顯示：與正常對照組兒童相比，PCG患兒血清中的病毒感染陽性率明顯升高。由于病例樣本數(shù)較少，尚未發(fā)現(xiàn)血清病毒抗體陽性組和血清病毒抗體陰性組之間臨床特征上的差異。但我們的結(jié)果提示，皰疹病毒感染可能與PCG的發(fā)生存在相關(guān)性，更大樣本的研究有待進(jìn)行；同時，關(guān)于皰疹相關(guān)病毒感染在PCG發(fā)病中的病理生理機(jī)制也需要進(jìn)一步的深入研究。