品種和成熟度對油橄欖鮮果功效成分及抗氧化能力的影響

熊政委，謝躍杰，黃梅桂，趙富昌，王仲明，任貴禮，王 強(qiáng),*

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 400067；2.重慶第二師范學(xué)院，脂質(zhì)資源與兒童日化品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；3.南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，江蘇 南京 210037；4.重慶江源油橄欖開發(fā)有限公司，重慶 404100）

油橄欖屬木犀科木犀欖屬常綠喬木，又名洋橄欖、齊墩果，是世界四大木本油料植物之一，主要分布于甘肅、重慶、云南、四川等地區(qū)[1]。油橄欖是一種高經(jīng)濟(jì)效益的樹種，其綜合利用價(jià)值較高，主產(chǎn)品為橄欖油，具有抗氧化、抗菌、抗癌等功效，享有“食用植物油皇后”的美譽(yù)；油橄欖鮮果還可加工成藥用或餐用油橄欖，作為藥材或蔬菜食用[2]；其榨油后的果渣可作提取載體、飼料、肥料或燃料[1,3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)油橄欖葉提取物具有抗氧化、降血糖、降血壓、抗動脈粥樣硬化作用[4-5]。自古以來，由油橄欖果制作的產(chǎn)品就被作為食物和傳統(tǒng)藥物使用[6]。油橄欖鮮果皮肉細(xì)嫩、清香適口，含有較豐富的營養(yǎng)成分，可以作為餐用蔬菜；同時(shí)，《滇南本草》中提到橄欖“治一切喉火上炎，大頭瘟癥，能解濕熱，生津止渴，利痰，解魚毒、酒、積滯”[7]?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，油橄欖鮮果含有豐富的酚酸類、黃酮類、裂環(huán)烯醚萜類（包括橄欖苦苷（oleuropein，OL））、維生素及色素類等生物活性成分[8]。

目前，關(guān)于油橄欖鮮果的研究主要集中于鮮果中黃酮類和多酚類化合物的提取和分析。鄧俊琳等[9]建立了測定油橄欖鮮果中沒食子酸、羥基酪醇（hydroxytyrosol，HT）、對香豆酸、蘆丁、OL和槲皮素6 種多酚化合物含量的高效液相色譜方法；并研究了不同成熟度對蛋白質(zhì)、還原糖、粗脂肪、總多酚含量的影響[10-11]。Salvador等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，收獲時(shí)間對橄欖油產(chǎn)量、品質(zhì)、穩(wěn)定性、感官特性有重要影響。影響橄欖油鮮果中化合物的組成及含量的因素很多，如遺傳因子、氣候因子、土壤因子、加工手段、采收時(shí)間等[13-19]。但迄今為止關(guān)于多個(gè)不同油橄欖鮮果品種及成熟度對其主要功效成分（總酚（total phenol，TP）、總類黃酮（total flavonoid，TF）、總黃烷-3-醇（total flavanols，TFL）、OL、HT）的報(bào)道還很少。因此，為評價(jià)油橄欖鮮果藥用和食用價(jià)值，本研究對具有代表性的10 個(gè)品種進(jìn)行功效成分分析；通過比較分析不同品種及成熟度（早、中、晚，分別記為I、II、III）油橄欖鮮果的功效成分和抗氧化能力，評價(jià)不同品種及成熟度間的品質(zhì)差異性，對橄欖品種的選育及采后加工具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試油橄欖鮮果采集于重慶、甘肅隴南油橄欖種植示范基地。實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選取不同株生長健壯、長勢一致的果樹為試材，共選取長勢良好、產(chǎn)量較穩(wěn)定的10 個(gè)品種：白橄欖、豆果、鄂植、佛奧、卡林、科拉蒂、克羅萊卡、皮瓜爾、云臺、配多靈，分別在早、中、晚（即I、II、III）成熟期采摘于油橄欖種植基地，每個(gè)品種選取3 株生長健壯、長勢一致的5 年生樹為試材。

兒茶素、焦性沒食子酸、1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、L-抗壞血酸、福林-酚、水溶性VE（Trolox）、p-二甲氨基肉桂醛（p-dimethylaminocinnamaldehyde，p-DMACA）、乙腈（色譜純） 美國Spectrum公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；所用水為雙蒸水，所用溶液均自行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JYL-C012料理機(jī) 九陽股份有限公司；高壓均質(zhì)機(jī) 上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 油橄欖鮮果原料預(yù)處理與提取

油橄欖鮮果的取樣根據(jù)GB/T 8855—2008《新鮮水果和蔬菜 取樣方法》[20]。將油橄欖果實(shí)去核，加液氮研成粉末，－80 ℃貯存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取200 g粉末，加入體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液，超聲提取25 min后，于4 ℃條件下5 000 r/min冷凍離心20 min，上清液即為油橄欖鮮果提取物，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不同品種及成熟度油橄欖鮮果TP、TF、TFL、OL、HT含量的測定

TP含量的測定采用福林-酚法[21]，以焦性沒食子酸-乙醇溶液（10～150 mg/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每克鮮果粉末含有沒食子酸質(zhì)量表示（μg/g）。TF含量采用三氯化鋁比色法測定[22]，以每克鮮果粉末含有兒茶素質(zhì)量表示（μg/g）。TFL含量采用p-DMACA法測定[23]，以每克新鮮樣品含有兒茶素質(zhì)量表示（μg/g）。OL和HT含量均采用色譜法測定[24-25]，均以每克鮮果粉末含有測試物質(zhì)量表示（μg/g）。

OL含量測定的超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）條件[24]：UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×1.0 mm，1.7 μm)，柱溫30 ℃；流動相：乙腈-水（21∶79，V/V）；檢測波長230 nm；紫外檢測器；流速1 mL/min。準(zhǔn)確稱取OL標(biāo)準(zhǔn)品7.88 mg，以甲醇定容至5 mL，混勻，配成質(zhì)量濃度為1.576 mg/mL的溶液；分別移取80、155、235、315、395 μL溶液用甲醇定容至5 mL。以峰面積對質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算OL含量，回歸方程為y＝6.217×10－8x（R2＝0.999 1）。

HT含量測定的UPLC條件：UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×1.0 mm，1.7 μm)；流動相：A為體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸-乙腈溶液，B為體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸-水溶液；流速0.15 mL/min；進(jìn)樣量2.0 μL；柱溫35 ℃；激發(fā)波長為300 nm，發(fā)射波長為350 nm；洗脫梯度：0～5.0 min，5%～8% A；5.0～8.0 min，8%～80% A；8.0～9.0 min，80%～5% A；平衡2.0 min。準(zhǔn)確稱取HT標(biāo)準(zhǔn)品1.20 mg，加體積分?jǐn)?shù)12%甲醇-磷酸溶液定容，混勻，配成質(zhì)量濃度為120 μg/mL溶液；按對半稀釋法分別配制3.75、7.50、15.00、30.00、60.00 μg/mL溶液，以峰面積對質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算HT含量，回歸方程為y＝2.462×10–5x－1.302×10－5（R2＝0.998 9）。

1.3.3 不同品種及成熟度油橄欖鮮果提取物抗氧化能力的測定

1.3.3.1 FRAP的測定

鐵離子還原能力（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）參考Benzie等[26]的方法。取500 μg油橄欖鮮果提取物，加入1.8 mL 2,3,5-氯化三苯基四氮（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TPTZ）工作液（由25 mL 0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、2.5 mL 10 mmol/L TPTZ溶液、2.5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液組成），混勻后37 ℃反應(yīng)15 min，測定吸光度A593nm，以1.0 mmol/L FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品FRAP以每100 g鮮果粉末達(dá)到同樣吸光度所需FeSO4的物質(zhì)的量表示（mmol/100 g）。

1.3.3.2 清除DPPH自由基能力的測定

清除DPPH自由基能力參考Liu Lixiang等[27]的方法進(jìn)行測定，將4 mL 95% DPPH-乙醇溶液（10－4mol/L）與油橄欖鮮果提取物500 μg混勻后測定吸光度A517nm，以Trolox為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，DPPH自由基清除能力，回歸方程為y＝3.526x－1.423（R2＝0.999 1），結(jié)果以每100 g鮮果粉末含有Trolox物質(zhì)的量表示（mmol/100 g）。

1.3.3.3 清除·OH能力的測定

清除羥自由基（·OH）能力的測定參照孫瑾等[28]的方法并略有修改。在比色管中依次加入1 mL 10 mmol/L FeSO4、1 mL 10 mmol/L水楊酸、油橄欖鮮果提取物500 μg，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2，37 ℃反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水作參比，在510 nm波長處測吸光度，并同時(shí)做不加FeSO4的空白樣品；以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算·OH清除能力，回歸方程為y＝2.566x－1.602（R2＝0.999 0），結(jié)果以每100 g鮮果粉末含有Trolox物質(zhì)的量表示（mmol/100 g）。

1.3.3.4 清除O2－·能力的測定

清除超氧陰離子自由基（O2－·）能力的測定參照孫瑾等[28]的方法并略有修改。取油橄欖鮮果提取物0.1 mg，加入0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）2.8 mL混勻，25 ℃水浴10 min后加入3 mmol/L的鄰苯三酚溶液（25 ℃水浴預(yù)熱）0.1 mL，混勻后迅速在420 nm波長處測定吸光度，每隔30 s讀取A420nm，5 min后結(jié)束。以去離子水0.1 mL和0.1 mol/L Tris-HC1緩沖液（pH 8.2）2.8 mL調(diào)零；空白對照管以去離子水代替油橄欖鮮果提取物。作吸光度隨時(shí)間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率v，按下式計(jì)算O2－·清除率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 ±s表示，用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異顯著，使用Origin 8.0軟件作圖。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行各元素間相關(guān)性分析（correlation analysis，CA），因多數(shù)變量不服從正態(tài)分布，故采用Spearman等級相關(guān)系數(shù)法。采用SAS 8.2軟件中PRINCOMP過程對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種及成熟度對油橄欖鮮果TP、TF、TFL、OL、HT含量的影響

圖1 品種及成熟度對油橄欖鮮果功效成分的影響Fig. 1 Effects of cultivar and maturity on functional composition content in fresh olive fruits

由圖1可知，在整個(gè)成熟過程中，對于同一個(gè)品種的鮮果而言，不同成熟度時(shí)TP和OL含量相對穩(wěn)定，分別介于（1 080.63±24.33）～（2 434.75±11.89）μg/g之間和（790.47±21.89）～（1 867.62±19.67）μg/g之間，不同成熟度之間其差異較小；TP含量最高的為第II成熟階段白橄欖品種，含量最低的為第II成熟階段云臺品種；OL含量最高的為第III成熟階段皮瓜爾品種，含量最低的為第II成熟階段佛奧品種。

在整個(gè)成熟過程中，僅白橄欖、豆果、鄂植和配多靈4 個(gè)品種的TF含量變化較大，其中第I成熟階段白橄欖品種TF含量最高，達(dá)到（1 824.7±42.37）μg/g；僅皮瓜爾和配多靈2 個(gè)品種的TFL含量變化較大，其中第III成熟階段皮瓜爾品種TFL含量最高，達(dá)到（380.86±6.21）μg/g。不同品種及成熟度對油橄欖鮮果HT含量的整體影響與TP、TF、TFL和OL含量不同，各品種和不同成熟階段鮮果中HT含量波動較大，介于（413.30±12.34）～（983.96±32.15）μg/g之間。

2.2 不同品種及成熟度油橄欖鮮果提取物的抗氧化能力分析

圖2 不同品種及成熟度對油橄欖鮮果提取物的抗氧化能力的影響Fig. 2 Effects of cultivar and maturity on antioxidant capacity of fresh olive fruit extracts

由圖2可知，隨著成熟度的增加，油橄欖鮮果提取物的抗氧化能力呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢，但是O2－·清除率無此規(guī)律。第III成熟階段的白橄欖、豆果、皮瓜爾和配多靈品種FRAP較強(qiáng)（均大于1.2 mmol/100 g）；第III成熟階段的白橄欖、豆果、佛奧、卡林、皮瓜爾品種DPPH自由基清除能力較強(qiáng)（均大于1.75 mmol/100 g）；第III成熟階段的白橄欖、豆果品種?OH清除能力較強(qiáng)（均大于1.6 mmol/100 g）；除了配多靈品種，油橄欖鮮果提取物清除O2－·的能力均隨著成熟度增加而總體呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢（第II成熟階段略有波動），其中卡林、克羅萊卡、皮瓜爾清除O2－·的能力較強(qiáng)。

2.3 油橄欖鮮果提取物中功效成分含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析

表1 不同品種及成熟度油橄欖鮮果提取物中功效成分含量與抗氧化能力的相關(guān)性Table 1 Correlation between functional composition and antioxidant capacity of fresh olive fruit extracts from different cultivars at different harvest dates

表1相關(guān)矩陣分析顯示，油橄欖鮮果提取物FRAP與TF、TFL和OL含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；其DPPH自由基清除能力與HT含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；其?OH清除能力與各功效成分含量均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）（除TFL含量）；其O2－·清除率與TF、TFL和OL含量均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

2.4 橄欖鮮果提取物中功效成分含量與抗氧化能力的PCA結(jié)果

PCA可以用于解釋和分析多維樣品之間的差異，從而進(jìn)一步分析“相似多維變量”之間的差異[29-31]。本實(shí)驗(yàn)通過對不同品種及成熟度油橄欖鮮果提取物的功效成分與抗氧化能力的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)特征值大于1的原則提取了3 個(gè)主成分（PCs），其方差貢獻(xiàn)率分別為43.42%、25.62%和9.52%，前2 個(gè)PCs數(shù)據(jù)反映了原始數(shù)據(jù)提供信息總量的78.56%。因此，將這2 個(gè)PCs作為評價(jià)所采集的樣品質(zhì)量的綜合變量，通過PC1-PC2散點(diǎn)圖即可直觀了解各個(gè)品種及其成熟度的聚類程度及分布（圖3）。

圖3 不同品種及成熟度油橄欖鮮果的PC1/PC2主成分散點(diǎn)圖Fig. 3 PCA scatter plot of PC1 vs. PC2 for fresh olive fruits from different cultivars at three harvest dates

3 討 論

油橄欖果作為一種綜合利用價(jià)值較高的木本油料，有著巨大的開發(fā)利用空間。鄧俊琳等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，8 個(gè)油橄欖品種（皮瓜爾、佛奧、克羅萊卡、卡林、鄂植、云臺、配多靈、科拉蒂）的總黃酮含量隨成熟度增加呈現(xiàn)先下降后略有上升的變化趨勢；隨著成熟度的增加，皮瓜爾品種TP含量先降低后趨于平穩(wěn)，這與本研究結(jié)果差異較大。究其原因在于，油橄欖果中黃酮類和多酚類化合物的積累、轉(zhuǎn)化、降解是一個(gè)復(fù)雜的過程，其結(jié)果受品種、成熟度、產(chǎn)地、采樣時(shí)間等諸多因素的影響，因此產(chǎn)地識別對橄欖果實(shí)具有重要研究價(jià)值。

朱慶平[29]、龍偉[32]、張東[33]等研究了我國8 個(gè)品種（鄂植8、城固32、皮削利、萊星、佛奧、阿貝奎納、皮瓜爾和奇跡）油橄欖果及初榨橄欖油的品質(zhì)，主要包括果實(shí)成熟度、大小、鮮果率、含水率、含油率以及橄欖油中脂肪酸組成、甘油三酯組成、生育酚、角鯊烯及甾醇等含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油橄欖果實(shí)中的金屬元素及角鯊烯等成分含量在不同品種之間存在著遺傳差異，這種差異也可作為油橄欖品種鑒定和分類的重要參考依據(jù)。功效成分的含量是評價(jià)油橄欖果品質(zhì)及其特性的重要指標(biāo)，筆者認(rèn)為，皮瓜爾、克羅萊卡的OL含量總體較高，可作為特殊用途油橄欖品種。對于油橄欖果實(shí)的研究今后還需要建立品種及成熟度對油橄欖鮮果金屬元素、全成分、功能、品質(zhì)等指標(biāo)影響的指紋圖譜及譜庫，從而為油橄欖副產(chǎn)物利用及品種培育提供參考。