人臍帶間充質干細胞向纖維環(huán)樣細胞分化的最佳誘導比例分析

欒雅靜，許海委，徐寶山，楊強

(1天津醫(yī)科大學，天津 300070；2天津市天津醫(yī)院)

椎間盤退變是下腰痛發(fā)病的最主要原因，利用組織工程學方法修復退變的椎間盤組織，以恢復椎間盤結構和功能，逐漸成為臨床治療下腰痛的研究重點[1]。目前用于構建組織工程椎間盤的種子細胞包括椎間盤纖維環(huán)細胞、髓核細胞及骨髓間充質干細胞等[2,3]，但均存在取材困難、對機體損傷較大及來源有限等問題。人臍帶間充質干細胞(以下簡稱臍帶干細胞)是存在于臍帶組織的一種新型間充質干細胞，其不但具有間充質干細胞的典型特征，還具有與胚胎間充質干細胞相似的高度體外富集和擴增特點；且來源廣泛、易于獲取、保存方便、無倫理學爭議、無免疫排斥反應[4]。研究發(fā)現(xiàn)，臍帶干細胞能在體外誘導分化為髓核細胞[5]，但目前鮮有關于體外誘導臍帶干細胞向纖維環(huán)細胞分化的研究。2016年1月～2018年1月，本研究采用體外共培養(yǎng)技術誘導臍帶干細胞向纖維環(huán)細胞分化，現(xiàn)分析結果并探討達到最佳誘導效果時二者的比例。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇天津市天津醫(yī)院婦產科出生的健康足月順產胎兒的臍帶約30 cm，本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核，胎兒父母均知情同意。選擇新西蘭大白兔2只，3～4 月齡，雌雄不限，體質量(2.5±0.5)kg，來源于天津市天津醫(yī)院實驗動物中心。主要試劑：人Ⅰ型膠原α2、人Ⅱ型膠原α1、人蛋白多糖AGC ELISA試劑盒均購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司， Anti-Collagen Ⅰ antibody ab34710、Anti-Collagen Ⅱ antibody ab34712均購于美國Abcam公司，SYBR Premix Ex Taq試劑盒購于日本TaKaRa公司。主要儀器：iQ5 real-time PCR擴增儀購于美國Applied Biosystems公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購于美國Thermo Forma公司，倒置顯微鏡購于日本Olympus公司，5415D型離心機購于德國Eppendorf公司。

1.2 人臍帶干細胞分離和培養(yǎng) 取臍帶組織，放入無菌D-Hank′s液中洗去殘留血液。將臍帶剪成4 cm大小節(jié)段，縱行剪開臍帶外膜，剝離血管。取血管之間以及血管與外膜之間的華通膠組織，D-Hank′s液沖洗后，剪切成約1 mm3大小碎塊，浸于0.075% Ⅱ型膠原酶溶液中，37 ℃恒溫消化18 h，2 500 r/min離心10 min后棄上清。剩余液體用0.25%胰蛋白酶于37 ℃條件下恒溫消化30 min，2 500 r/min離心10 min后棄上清。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，調整細胞密度至1×105/mL，移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。半量換液除去未貼壁細胞，每3天換液1次。

1.3 兔纖維環(huán)細胞分離和培養(yǎng) 將2只新西蘭大白兔耳緣靜脈注射空氣處死，無菌條件下取出胸、腰段脊柱。去除軟骨終板及周圍肌肉、韌帶組織，分離椎間盤組織，用D-Hank′s 液漂洗2遍后分離纖維環(huán)組織。用剪刀將纖維環(huán)組織剪碎成乳糜狀，經0.25%胰蛋白酶預消化2 h。加入血清終止胰酶消化，1 000 r/min離心10 min后棄上清。加入0.2 % Ⅱ型膠原酶重懸細胞及組織塊，組織塊完全消化后過濾，1 000 r/min離心10 min收集沉淀細胞。用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，調整細胞密度至1×105/mL，移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次。

1.4 人臍帶干細胞與兔纖維環(huán)細胞共培養(yǎng) 取第二代臍帶干細胞消化后制備單細胞懸液，調整細胞密度為2×104/mL。取第二代兔纖維環(huán)細胞消化后制備單細胞懸液，調整細胞密度分別為1×104/mL、2×104/mL、4×104/mL。將臍帶干細胞隨機分為0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組，各組均取2×104/mL濃度臍帶干細胞單細胞懸液1 mL接種于Transwell 6孔板下層；1∶2組、1∶1組、2∶1組分別取細胞密度為1×104/mL、2×104/mL、4×104/mL的兔纖維環(huán)細胞單細胞懸液1 mL接種于Transwell 6孔板上層，使纖維環(huán)細胞與臍帶干細胞的比例分別為1∶2、1∶1、2∶1。加入培養(yǎng)液，通過0.4 μm的微孔濾膜相通形成共培養(yǎng)，培養(yǎng)14天。

1.5 臍帶干細胞向纖維環(huán)細胞分化的誘導效果觀察

1.5.1 各組臍帶干細胞形態(tài)學變化 培養(yǎng)14天，收集各組臍帶干細胞，倒置顯微鏡下觀察臍帶干細胞形態(tài)變化。

1.5.2 各組臍帶干細胞中纖維環(huán)細胞相關基因Ⅰ型膠原、蛋白聚糖mRNA表達 采用實時熒光定量PCR法。培養(yǎng)14天，收集各組臍帶干細胞，加入細胞裂解液進行裂解，采用TRIzol法提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書檢測Ⅰ型膠原、蛋白聚糖mRNA相對表達量。Ⅰ型膠原上游引物：5′-TGCTCGTGGAAATGATGGTG-3′，下游引物：5′-CCTCGCTTTCCTTCCTCTCC-3′，引物長度450 bp。蛋白聚糖上游引物: 5′-AAGGGCGAGTGGAATGATGT-3′，下游引物：5′-CGTTTGTAGGTGGTGGCTGTG-3′，引物長度100 bp。內參β-actin上游引物：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下游引物： 5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3 ′，引物長度501 bp。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔC法計算Ⅰ型膠原、蛋白聚糖 mRNA相對表達量。

1.5.3 各組臍帶干細胞中纖維環(huán)細胞相關基因Ⅰ型膠原、蛋白聚糖蛋白表達檢測 ①采用ELISA法。培養(yǎng)14天，收集各組臍帶干細胞，采用預冷的PBS沖洗5 min×3次。每1×106個細胞中加入200 μL PBS，重懸并反復凍融使細胞破碎，1 500 r/min離心10 min，取上清液。采用ELISA法檢測Ⅰ型膠原、蛋白聚糖表達，嚴格按照試劑盒說明書操作。②采用免疫細胞化學染色法。培養(yǎng)14天，取各組臍帶干細胞爬片后PBS沖洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.3% H2O2封閉內源性過氧化物酶室溫10 min；PBS沖洗5 min×3次；0.25%Triton X-100室溫孵育標本10 min，沖洗5 min×3次；加入10%羊血清室溫條件下封閉30 min，甩去血清。加入Anti-Collagen Ⅰ antibody ab34710(稀釋比例為1∶300)，4 ℃孵育過夜；加入羊抗兔二抗(稀釋比例為1∶300)，室溫條件下孵育1 h。PBS沖洗5 min×3次，加入SABC復合物，室溫下作用30 min～1 h。DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明20 min，中性樹膠封固。200倍光鏡下采用半定量積分法判定結果，即根據(jù)每張切片的陽性細胞比例及著色程度進行評分。陽性細胞比例評分：陽性細胞數(shù)<10%為1分，10%～30%為2分，>30%為3分；著色程度評分：未著色為0分，淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分。將兩項得分結果相乘，0為陰性，1～2為弱陽性，3～4為陽性，4以上為強陽性。

2 結果

2.1 各組臍帶干細胞形態(tài)學變化比較 0∶1組臍帶干細胞多呈長梭形。1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細胞形態(tài)逐漸變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?，細胞出現(xiàn)多個突起，局部區(qū)域相鄰細胞突起連成網狀；隨著纖維環(huán)細胞的比例升高，臍帶干細胞上述變化越明顯，越接近纖維環(huán)細胞的形態(tài)學特征，2∶1組纖維環(huán)細胞的形態(tài)學特征最明顯。

2.2 各組臍帶干細胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖 mRNA相對表達量比較 0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖 mRNA相對表達量均依次升高，兩組間比較P均<0.01。見表1。

表1 各組臍帶干細胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖 mRNA相對表達量比較

注：與0:1組比較，aP<0.01；與1∶2組比較，bP<0.01；與1∶1組比較，cP<0.01。

2.3 各組臍帶干細胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖蛋白表達比較 0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖表達均依次升高，兩組間比較P<0.05或<0.01。見表2。0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細胞中Ⅰ型膠原蛋白表達分別呈陰性、弱陽性、陽性及強陽性。

表2 各組臍帶干細胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖蛋白表達比較

注：與0∶1組比較，aP<0.01；與1∶2組比較，bP<0.05，cP<0.01；與1∶1組比較，dP<0.01。

3 討論

研究證實，臍帶干細胞是一種多潛能成體干細胞，具有多向分化潛能。臍帶干細胞可分化為脂肪細胞、軟骨細胞、胰島細胞、骨骼肌細胞等[6～8]；經體外誘導后可分化為椎間盤樣細胞[9]，且間充質干細胞和椎間盤細胞共培養(yǎng)后能明顯促進椎間盤細胞外基質合成[10]。本研究結果顯示，當纖維環(huán)細胞與臍帶干細胞共培養(yǎng)時，臍帶干細胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?，并開始出現(xiàn)細胞突起，出現(xiàn)纖維環(huán)細胞的形態(tài)學特征，進一步證實二者共培養(yǎng)可誘導臍帶干細胞向纖維環(huán)細胞分化。

目前關于纖維環(huán)細胞通過共培養(yǎng)技術誘導臍帶干細胞分化的最適誘導濃度尚不明確，以往的研究多采用1∶1的細胞比例。張燕等[11]報道，采用細胞比例為1∶1的共培養(yǎng)體系能誘導臍帶干細胞向NP細胞分化。張明等[12]報道，骨髓間充質干細胞與纖維環(huán)細胞按1∶1比例共培養(yǎng)后，骨髓間充質干細胞具有向纖維環(huán)細胞分化的可能。本研究將纖維環(huán)細胞與臍帶干細胞按照不同比例進行共同培養(yǎng)，結果顯示，纖維環(huán)細胞與臍帶干細胞共培養(yǎng)時，纖維環(huán)細胞的比例越高，臍帶干細胞出現(xiàn)的纖維環(huán)細胞的形態(tài)學特征越明顯；當二者比例為2∶1時誘導效果最佳。Ⅰ型膠原和蛋白聚糖是纖維環(huán)細胞的主要成分，目前均為作為纖維環(huán)細胞的標記物。Ⅰ型膠原和蛋白聚糖是關節(jié)盤行使功能的主要細胞外基質成分，且蛋白聚糖在關節(jié)盤中間帶承受壓縮力過程中起重要作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原和蛋白聚糖基因在纖維環(huán)細胞中呈高表達，而在臍帶干細胞中呈低表達，故誘導后臍帶干細胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖基因表達在一定程度上可反映臍帶干細胞向纖維環(huán)細胞分化的程度。本研究結果顯示，0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖 mRNA相對表達量及Ⅰ型膠原、蛋白聚糖蛋白表達均依次升高，兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義。說明纖維環(huán)細胞與臍帶干細胞共培養(yǎng)可促進臍帶干細胞表達纖維環(huán)細胞相關基因，并分泌纖維環(huán)細胞相關細胞基質，且纖維環(huán)細胞與臍帶干細胞比例為2∶1時效果最明顯。

纖維環(huán)細胞成分主要以Ⅰ型膠原蛋白為主，而髓核細胞則以Ⅱ型膠原蛋白為主。Ⅰ型膠原蛋白使纖維環(huán)細胞具有較好的張力，有助于維持細胞形態(tài)，更好地承受來自脊柱不同方向的牽引力。本研究結果顯示，0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細胞中Ⅰ型膠原蛋白表達分別呈陰性、弱陽性、陽性及強陽性；提示臍帶干細胞與纖維環(huán)細胞共培養(yǎng)可誘導臍帶干細胞分化為纖維環(huán)細胞，并使其具備合成Ⅰ型膠原蛋白的能力，且纖維環(huán)細胞與臍帶干細胞比例為2∶1時的效果最明顯。

綜上所述，纖維環(huán)細胞與臍帶干細胞共培養(yǎng)能誘導臍帶干細胞向纖維環(huán)細胞分化，二者共培養(yǎng)的最佳比例為2∶1。