仿生金線蓮有效成分含量及影響因素研究

楊開興

（福建省邵武市二都國(guó)有林場(chǎng)，福建 邵武 354000）

金線蓮[Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.]，為多年生蘭科開唇蘭屬名貴中草藥，素有 “藥王”、“金草”、“鳥人參”等美稱。廣泛分布于熱帶亞洲至大洋洲，我國(guó)福建、臺(tái)灣、廣東、廣西均有野生品種，其中以福建金線蓮的藥用品質(zhì)最高[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，金線蓮鎮(zhèn)痛作用比嗎啡強(qiáng)10-40倍[3]，同時(shí)具有抗衰老、提高機(jī)體免疫力等的藥用價(jià)值[4]。研究顯示，上述藥用品質(zhì)主要與黃酮類、糖類、氨基酸等藥用成分及其合成酶活性密切相關(guān)[5-7]。

野生金線蓮目前已經(jīng)瀕臨滅絕，商品金線蓮大都源自大棚種植甚至組織培養(yǎng)[8-9]。人工栽培金線蓮一定程度滿足了市場(chǎng)對(duì)金線蓮數(shù)量的需求，但其療效和野生金線蓮存在較大差距，不符合傳統(tǒng)中藥的“道地性”要求[10-11]。如何提高人工栽培金線蓮藥用質(zhì)量成為金線蓮種植亟需解決的問題。

仿生態(tài)種植是將植物體種植于原生或類似生境中，使其獲得野生種某些特性的一種人工栽培方式[12]。中藥材品質(zhì)與生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)，環(huán)境條件不僅影響其有效成分含量，而且影響成分之間的比例。因此，仿生態(tài)栽培對(duì)于提高中藥材的藥用品質(zhì)效果良好，已有多種中草藥的仿生態(tài)種植獲得成功[13]。然而迄今為止，金線蓮仿生態(tài)栽培還處于起步階段。仿生態(tài)栽培過程中，金線蓮各種藥用成分及其相關(guān)酶活性發(fā)生何1種變化以及造成這些變化的原因也未可知，影響了金線蓮仿生栽培方式的推廣應(yīng)用。

鑒于此，本研究將金線蓮組培苗進(jìn)行仿生態(tài)種植。監(jiān)測(cè)其仿生栽培過程中金線蓮總多糖、總黃酮、游離氨基酸含量以及PAL酶活性的變化，同時(shí)比較仿生金線蓮上述指標(biāo)與野生金線蓮之間的差異，結(jié)合期間環(huán)境因子的變化，探討影響仿生金線蓮藥用成分變化的主要因素，為金線蓮仿生栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 仿生樣地設(shè)置及樣品采集

依據(jù)野生金線蓮生長(zhǎng)環(huán)境，選擇類似植被群落和土壤理化性質(zhì)的天然闊葉林地為仿生金線蓮種植樣地，每塊樣地大小約為5 m×5 m，共設(shè)置5塊樣地。樣地位于福建省邵武市二都伐木場(chǎng)林地。

2016年4月份栽培組培金線蓮苗（組培苗購(gòu)置于市場(chǎng)，苗齡為3個(gè)月），除模擬降雨噴灌及適度（30%）遮陰，無(wú)其他人工干預(yù)。于當(dāng)年 5、6、7.5、9、12月及次年2月共采集6批次金線蓮樣品，每批次每塊樣地的采集量約為200 g左右，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。同時(shí)搜集野生福建金線蓮（生長(zhǎng)1年左右，共收集野生樣品100 g）和成品大棚種植的福建金線蓮（生長(zhǎng)8個(gè)月，共250 g）樣品。部分新鮮樣品直接用于PAL酶活性的測(cè)定，其余樣品烘干、研磨后用于金線蓮多糖、氨基酸、黃酮含量的測(cè)定，每份樣品作3次重復(fù)。

1.2 環(huán)境參數(shù)、有效成分和PAL酶活性測(cè)定

金線蓮多糖含量采用熱水浸提-苯酚-硫酸法測(cè)定[14]；總黃酮含量采用超聲提取-紫外分光光度法測(cè)定[15]；游離氨基酸含量采用超聲提取-茚三酮顯色法測(cè)定[16]；試劑盒法（ELISA測(cè)定試劑盒）測(cè)定PAL酶活性[11]。

每天早上9：00和下午3：00對(duì)仿生金線蓮種植林地及野生金線蓮林地的光照、空氣濕度、空氣溫度、土壤濕度和土壤溫度進(jìn)行測(cè)量記錄，計(jì)算日及月平均環(huán)境參數(shù)變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

環(huán)境參數(shù)分別按樣地編號(hào)作日平均后再按月份取平均值，多糖、氨基酸、黃酮和PAL酶活性則按批次分別取均值。后用Excel和SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 仿生樣地環(huán)境參數(shù)變化特征

試驗(yàn)樣地空氣濕度于49.7%~97.9%之間變化，而同一時(shí)期土壤濕度則明顯小于空氣濕度（19.8%~30.4%）（圖1）。不同地塊空氣溫度變化較為穩(wěn)定（18.1-33.7℃），土壤溫度則較為接近于空氣溫度，均值為16.8-29.0℃。同一時(shí)間不同地塊光照強(qiáng)度存在較大差異，其中4、5、6月差值相對(duì)很小，而7、8月光照強(qiáng)度差值增大，可能與夏季太陽(yáng)高度角有關(guān)?？傮w上，樣地間環(huán)境參數(shù)比較接近。野生金線蓮林地8月份環(huán)境參數(shù)（光照度：800 lx、土壤濕度：25% 、土壤溫度：15.7 ℃、空氣濕度：78%、空氣溫度：18.7℃）與同月份仿生樣地環(huán)境參數(shù)接近，說明試驗(yàn)樣地的微域氣候基本符合仿生態(tài)種植標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 樣地環(huán)境因子時(shí)間變化Figure 1 Type place environment factor time variation

2.2 有效成分及PAL酶活性的變化

2.2.1 多糖總量

多糖在植物合成代謝較旺盛時(shí)大量累積，并在逆境中消耗[17]。數(shù)據(jù)顯示（圖2），仿生金線蓮多糖含量變化幅度較小，略有增加，最終接近野生金線蓮中的含量（20.6%）。其變化可能與金線蓮生長(zhǎng)周期有關(guān)。移栽時(shí)為春夏之交（0-3個(gè)月），金線蓮營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，因此多糖類物質(zhì)累積。此后夏秋季（4-6個(gè)月）的干旱和高溫對(duì)多糖累積不利，造成其含量下降。由于金線蓮每年10月份左右開花，因此8-10個(gè)月期間多糖含量的再次上升和下降可能與金線蓮生殖生長(zhǎng)有關(guān)。

圖2 金線蓮的有效成分含量測(cè)定結(jié)果Figure 2 Anoectochilus roxburghii's effective component content determination result

2.2.2 游離氨基酸總量

金線蓮中游離氨基酸含量變化大致表現(xiàn)為先下降后上升，并最終穩(wěn)定在1.0%左右，與野生植株游離氨基酸含量十分近似（1.0%）。最初游離氨基酸含量較高可能與組培苗的基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)較為豐富有關(guān)，移栽于自然環(huán)境后，原先累積的氨基酸被逐漸消耗，因此含量下降。由于缺水及低溫會(huì)引起植物體內(nèi)氨基酸含量的增加[18]。因此3個(gè)月后氨基酸含量上升可能與栽培林區(qū)夏秋季雨量減少密切相關(guān)。

2.2.3 PAL酶活性

PAL酶是植物黃酮類化合物產(chǎn)生過程中關(guān)鍵的酶類，生存逆境會(huì)誘導(dǎo)編碼PAL酶的mRNA量增加，從而提高PAL酶活性[19-20]。仿生栽培過程中金線蓮的PAL酶活性發(fā)生了大幅度變化。移栽一個(gè)月后金線蓮PAL酶活性大幅度上升，可能由于生長(zhǎng)環(huán)境的巨大變化，刺激了PAL酶活性的增長(zhǎng)。隨著幼苗對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)，在其后的5個(gè)月間，PAL酶活性逐漸下降。6個(gè)月后，PAL酶活性再次大幅度提升，以應(yīng)對(duì)秋冬季降雨量和溫度的下降。由于大部分時(shí)期仿生金線蓮PAL酶活性大部分高于野生金線蓮（37.5%），說明外界環(huán)境條件變化對(duì)PAL酶活性影響較大。

2.2.4 總黃酮含量

黃酮屬于植物體次生化合物，具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、避免紫外線損傷等作用[21]。仿生栽培頭1個(gè)月，總黃酮含量先急劇減少，表明植物體不適應(yīng)環(huán)境，不斷消耗原先累積的物質(zhì)。此后穩(wěn)步攀升，至5個(gè)月到達(dá)頂峰，略低于野生金線蓮（4.0%）。說明這一時(shí)期植物體對(duì)環(huán)境逐步適應(yīng)，隨著初級(jí)代謝的增強(qiáng)，次生代謝物也逐步累積。5個(gè)月后其含量緩慢下降，表明秋冬季節(jié)轉(zhuǎn)變或生殖生長(zhǎng)促使植物體內(nèi)次生代謝物逐步消耗。

2.3 有效成分、PAL酶活性與環(huán)境因子的相關(guān)分析

相關(guān)分析表明（表1），有效成分、PAL酶活性與大部分環(huán)境參數(shù)相關(guān)性并不顯著，說明環(huán)境條件對(duì)植物生理生化的影響較為復(fù)雜。僅PAL酶活性與空氣濕度和空氣溫度相關(guān)性達(dá)到極顯著和顯著水平，r值分別為0.993和-0.969。此外土壤溫度和光照強(qiáng)度也可能是影響PAL酶活性變化的重要因素?？諝鉂穸扰c降雨量密切相關(guān)，表明長(zhǎng)時(shí)間降雨促進(jìn)PAL酶活性提升；空氣溫度與季節(jié)變化有關(guān)，說明長(zhǎng)時(shí)間的高溫天氣抑制了PAL酶活性。

表1 仿生態(tài)栽培金線蓮中有效成分與環(huán)境因子相關(guān)性分析Table1 Imitates the ecology to cultivate in anoectochilus roxburghii the effective component and the environment factor relevance analysis

3 討論

金線蓮仿生栽培面臨較為復(fù)雜的自然環(huán)境，其生理生化活性變化是多因素綜合作用的結(jié)果。本研究表明，3種活性成分以多糖的累積量最高，波動(dòng)幅度最小。這可能與多糖為重要的初生代謝產(chǎn)物，為金線蓮提供生存所需的物質(zhì)和能量有關(guān)[12]。黃酮總量超過了游離氨基酸含量，說明黃酮類是金線蓮重要的次生物質(zhì)，以應(yīng)對(duì)環(huán)境變化。相比多糖和氨基酸，栽培過程中黃酮含量變化幅度最大，說明仿生金線蓮的黃酮含量容易受環(huán)境因素影響。研究顯示，初生代謝在金線蓮生理活動(dòng)中占據(jù)主導(dǎo)地位，而次生代謝則受環(huán)境調(diào)控明顯。因此，金線蓮仿生栽培過程不僅要重視生物量增長(zhǎng)，更應(yīng)密切關(guān)注環(huán)境變化帶來的活性成分的累積變化，從而提高金線蓮的藥用品質(zhì)。

分析顯示，多糖、黃酮和游離氨基酸等總量指標(biāo)對(duì)環(huán)境條件的變化不敏感。鑒于上述指標(biāo)均包含多種化學(xué)成分，未來應(yīng)就各總量指標(biāo)的具體組分展開更為細(xì)致的研究，揭示它們與環(huán)境因子之間的有機(jī)聯(lián)系。。其中，PAL酶活性指標(biāo)對(duì)外界條件變化較為敏感，說明外界條件變化直接影響了酶活性，但其活性與黃酮累積量之間的關(guān)系并不明確。表明金線蓮仿生栽培面臨較為復(fù)雜的自然環(huán)境，黃酮類化合物的累積是合成代謝與分解代謝綜合作用的結(jié)果。將來應(yīng)就黃酮類代謝通路上更多的酶活性進(jìn)行研究。

本研究中，隨著栽培時(shí)間的增加，仿生栽培金線蓮黃酮、游離氨基酸和多糖含量均表現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，最終它們的含量趨近于野生金線蓮。它們含量的變化與季節(jié)轉(zhuǎn)換和植物體生物學(xué)特性有關(guān)。其中，值得關(guān)注的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為金線蓮移栽5-6個(gè)月左右，即9-10月份，植物體總黃酮和游離氨基酸含量達(dá)到當(dāng)年的最大水平。這一結(jié)論可為仿生栽培金線蓮最佳采收時(shí)間提供參考。由于金線蓮為多年生植物，仿生栽培金線蓮最佳采收時(shí)間為當(dāng)年或次年9-10月份，符合植物生長(zhǎng)規(guī)律。具體適宜時(shí)間還需進(jìn)一步權(quán)衡，達(dá)到藥物品質(zhì)和收益的最大化。