澳洲茄邊堿通過逆轉(zhuǎn)TAMs表型抑制CNE-1裸鼠移植瘤增殖的機(jī)制

★ 梁琰（北大醫(yī)療淄博醫(yī)院 山東 淄博 255069）

鼻咽癌在我國的發(fā)病率和死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于世界平均水平，且預(yù)后效果較差、生存率較低［1］。近年來，腫瘤微環(huán)境逐漸成為研究熱點(diǎn)，其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確。而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumorassociated macrophages，TAMs）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其與腫瘤細(xì)胞相互作用，能夠分泌多種與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等密切相關(guān)的細(xì)胞因子，

進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和耐藥等［2］。但TAMs所具有的表型轉(zhuǎn)化機(jī)制為巨噬細(xì)胞免疫重塑提供了先決條件，也為腫瘤治療提供了一個重要方向。本文通過建立人鼻咽癌CNE-1裸鼠移植瘤模型，探討澳洲茄邊堿對腫瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響，并檢測外周血中相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況，從逆轉(zhuǎn)TAMs表型角度探討澳洲茄邊堿與細(xì)胞增殖的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物與瘤株實(shí)驗(yàn)動物為SPF級BALB/C裸鼠，18～20g，雄性，36只，購于北京維通利華有限公司，動物合格證編號：11400700223248。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度為18℃～29℃，日溫差≤3℃，相對濕度達(dá)40%～70%，新鮮空氣換氣次數(shù)10次/h，氣流速度≤0.18m/s，壓差25Pa，潔凈度一萬級，氨濃度15mg/m3，噪音≤ 60dB，照度 150～300Lux。人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1購于中科院細(xì)胞庫。

1.2 藥物與造模澳洲茄邊堿單體購于成都曼斯特公司。造模：取對數(shù)生長的CNE-1細(xì)胞株，用含2%的血清的1640培養(yǎng)基稀釋為1.5×107/mL，以1mL注射器吸取100μL細(xì)胞懸液，皮下注射于裸鼠右側(cè)腋下，5天后長出米粒樣質(zhì)硬瘤體，造模成功。

1.3 其他實(shí)驗(yàn)材料與儀器RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，批號：C11875500CP）；胎牛血清（Gibco公司，批號：1600044）；胰酶（Gibco公司，批號：25200072）；磷酸鹽緩沖液（HyClone公司，批 號：SH30256.01B）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa公司，貨號：RR047A）；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa公司，貨號：RR820A）；6孔板（Thermo公司，批號：140675）；12孔板（Corning公司，批號：3513）、96孔板（Corning公司，批號：3599）；ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，IL-4批號：EK0405，IL-6批號：EK0411、IL-10批號：EK0417、IL-12批號：EK0932、IL-13批號：EK0425、TNF-α批號：EK0527）。

高速勻漿機(jī)（Bertin公司）；全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Inno-Alliance Biotech公司）；離心機(jī)（京立離心機(jī)有限公司，型號：LD5-10B）；正置顯微鏡（Leica公司，型號：DC300F）；多標(biāo)記微孔板檢測儀（PerkinElmer公司，型號：VICTORTMX5）；冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，型號：5430R）。

1.4 分組及處理將裸鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為：荷瘤對照組、澳洲茄邊堿低劑量組（4mg/kg）、澳洲茄邊堿高劑量組（8mg/kg）。從第5日起，荷瘤對照組隔日皮下注射生理鹽水0.2mL，實(shí)驗(yàn)組隔日皮下注射相應(yīng)濃度藥液0.2mL。每天觀察并記錄裸鼠的進(jìn)食、飲水、二便、毛發(fā)的光亮程度及精神狀態(tài)等情況；隔日一次，用電子秤記錄裸鼠的體重、游標(biāo)卡尺記錄瘤體的長徑和短徑，腫瘤體積=長徑×短徑2/2；第19天最后一次給藥24h后將裸鼠眼眶靜脈取血保留，將腫瘤剝出，稱重。

1.5 Real-time quantitative PCR實(shí)驗(yàn)檢測組織中ki-67表達(dá)用TRIZOL法提取組織中總RNA，使用分光光度法測定RNA濃度和純度，按1μg的總RNA擬轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因片段，基因引物序列見表1。按照Real-time quantitative PCR 試 劑 盒 說 明：2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10μL，上下游引物（10μM）各 0.8μL，cDNA 模 板 2μL，DEPC 水 6μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4μL，總反應(yīng)體系為20μL。按照擴(kuò)增試劑盒程序：預(yù)變性95℃，30s；PCR反應(yīng)95℃，5s；60℃ 34s，退火40個循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct算法計(jì)算相對基因表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.6 靜脈血中各類細(xì)胞因子的測定以ELISA試劑盒檢測裸鼠靜脈血中各細(xì)胞因子的含量。裸鼠血清的制備：眼眶靜脈取血后置于離心機(jī)以3000r/min離心15min，去上層血清置于離心管，保存于-80℃冰箱備用。按ELISA試劑盒說明書步驟分別測量裸鼠血清中 IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TNF-α的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ）表示，經(jīng)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均具有方差齊性，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠生存觀察接種4天后，各組裸鼠右側(cè)腋下均長出米粒樣質(zhì)硬瘤體，接種7天后，各組瘤體生長速度明顯加快，且裸鼠逐漸出現(xiàn)不活潑、行動遲緩、食欲不振、聚集、毛發(fā)脫落、無光澤等現(xiàn)象。對比各組裸鼠生存變化，其中，荷瘤對照組一般情況未見明顯異常，澳洲茄邊堿低劑量組一般情況較差，澳洲茄邊堿高劑量組一般情況最差。實(shí)驗(yàn)中，無裸鼠因藥物毒副作用而死亡。

2.2 瘤體體積及瘤重用游標(biāo)卡尺測量瘤體的長徑和短徑，計(jì)算瘤體體積，見表2。給藥前（第4天）各組瘤體體積基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；分組給藥后，各組瘤體體積大小關(guān)系為：高劑量組＜低劑量組＜荷瘤對照組。其中，第16天、第20天，高劑量組與荷瘤對照組瘤體體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第20天，低劑量組與荷瘤對照組瘤體體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第16天、第20天，高劑量組與低劑量組瘤體體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組裸鼠皮下瘤體體積（ ，n=12）

接種20天，最后一次給藥24h后，將裸鼠腫瘤剝出，稱重，見表3。澳洲茄邊堿給藥組瘤重明顯小于荷瘤對照組（P＜0.05），且高劑量組瘤重小于低劑量組（P＜0.05）。綜上提示，澳洲茄邊堿能夠抑制CNE-1腫瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖，且呈濃度依賴性。

表3 各組裸鼠瘤重（ ，n=12）

2.3 組織中ki-67mRNA表達(dá)Real-time quantitative PCR結(jié)果顯示，各組裸鼠腫瘤組織中ki-67mRNA表達(dá)比較：高劑量組＜低劑量組＜荷瘤對照組，給藥組與荷瘤對照組表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高劑量組與低劑量組表達(dá)的差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 各組裸鼠腫瘤組織中ki-67mRNA表達(dá)（ ，n=6）

2.4 靜脈血中IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TNF-α含量接種20天，最后一次給藥24h后，裸鼠眼眶取靜脈血，ELISA試劑盒檢測IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TNF-α含量，見表5。與荷瘤對照組相比，澳洲茄邊堿給藥組靜脈血中IL-4、IL-6、IL-10、IL-13細(xì)胞因子含量降低（P＜0.05）；IL-12、TNF-α細(xì)胞因子含量增加（P＜0.05）。

表5 各組裸鼠外周血相關(guān)細(xì)胞因子含量（ ，n=6）

3 討論

中藥龍葵是茄科植物龍葵干燥地上部分，味苦、微甘，性寒，因有清熱解毒、消炎利尿、消腫散結(jié)等功效，多用于治療瘡癤腫痛、小便不利、腫瘤等。研究發(fā)現(xiàn)，龍葵能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干擾細(xì)胞周期等，已用于治療肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、口腔癌等［3-4］。澳洲茄邊堿是一種天然甾體類生物堿糖苷化合物和細(xì)胞毒性劑，提取自龍葵，在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、凋亡等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。Liang C H等研究發(fā)現(xiàn)澳洲茄邊堿能增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對TNFs的敏感性［5］，在白血病細(xì)胞中可通過激活溶酶體、線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］，可激活 AMPKα/NF-κB/MUC1抑制前列腺癌細(xì)胞生長［7］。澳洲茄邊堿的抗腫瘤特性成為近年來研究熱點(diǎn)。

在腫瘤微環(huán)境影響下，外周血單核細(xì)胞遷移浸潤到腫瘤組織中，逐漸分化形成腫瘤巨噬細(xì)胞TAMs，目前發(fā)現(xiàn)TAMs與結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8-9］。受腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的影響，大多數(shù)TAMs呈現(xiàn)類M2型巨噬細(xì)胞的免疫特性，而M2型巨噬細(xì)胞具有免疫抑制和促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用［10］。研究表明，TAMs能夠促進(jìn)腫瘤生長、血管生成、腫瘤基質(zhì)重塑和免疫抑制等，并且與腫瘤患者不良預(yù)后相關(guān)［11］。TAMs表型保留極化可塑性的能力，在腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子的影響下，可由免疫抑制表型M2轉(zhuǎn)化為M1型，而與M2型不同，M1型巨噬細(xì)胞具有高度殺菌和抗腫瘤特性，能夠激活機(jī)體特異性免疫應(yīng)答。TNF-α、IL12等Th1細(xì)胞因子富集時(shí)，可誘導(dǎo)形成M1型巨噬細(xì)胞；IL-4、IL-6、IL-10、IL-13等Th2細(xì)胞因子富集時(shí)，可誘導(dǎo)形成M2型巨噬細(xì)胞［12-13］。因此，通過改變腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子表達(dá)量，將TAMs由M2型轉(zhuǎn)化為M1型，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長發(fā)展。

ki-67細(xì)胞核抗原在細(xì)胞有絲分裂的G1期、S期、G2期和M期均有合成，因此，ki-67增殖指數(shù)是反映腫瘤細(xì)胞增殖的重要指數(shù)［14］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，澳洲茄邊堿能夠以濃度依賴性抑制裸鼠移植瘤瘤體體積和重量，在分子層面能夠下調(diào)ki-67mRNA表達(dá)，表明澳洲茄邊堿能夠抑制CNE-1鼻咽癌細(xì)胞增殖。進(jìn)一步探索其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，澳洲茄邊堿能夠下調(diào) IL-4、IL-6、IL-10、IL-13等Th2細(xì)胞因子表達(dá)，上調(diào)TNF-α、IL12等Th1細(xì)胞因子，表明澳洲茄邊堿通過逆轉(zhuǎn)TAMs表型，抑制細(xì)胞增殖。