骨性關(guān)節(jié)炎中l(wèi)ncRNA MEG3的表達及其與VEGF的相關(guān)性分析

劉振峰 梁治權(quán) 鄧迎杰 方銳 孟慶才

[摘要] 目的 檢測長鏈非編碼RNA母系表達基因3（lncRNA MEG3）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在骨性關(guān)節(jié)炎（OA）軟骨組織中的表達情況，并分析lncRNA MEG3表達與VEGF表達之間的相關(guān)性。 方法 2014年1月～2015年12月，收集新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院40例原發(fā)性O(shè)A患者和20例志愿者的正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織；番紅O對軟骨組織進行染色后，改良Mankin評分標準對OA患者進行分組；實時定量熒光PCR試驗檢測各膝關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA MEG3和VEGF mRNA表達水平，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試驗檢測VEGF蛋白水平。Pearson相關(guān)系數(shù)法分析lncRNA MEG3表達與VEGF表達之間的相關(guān)性。 結(jié)果 Real-time PCR結(jié)果顯示，與正常軟骨組織相比，lncRNA MEG3在OA患者軟骨組織中相對表達量顯著降低（P < 0.05），且軟骨退化程度越高，lncRNA MEG3相對表達量越低（P < 0.05）。VEGF mRNA和VEGF蛋白相對表達量在OA患者軟骨組織中均顯著高于正常軟骨組織（P < 0.05），且軟骨退化程度越高，VEGF mRNA和VEGF蛋白相對表達量越高（P < 0.05）。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，lncRNA MEG3表達與VEGF表達之間呈負相關(guān)（r = -0.466，P < 0.05）。 結(jié)論 lncRNA MEG3在OA軟骨組織中低表達，且與VEGF表達之間呈負相關(guān)，提示lncRNA MEG可能通過調(diào)節(jié)血管生成參與原發(fā)性O(shè)A的發(fā)生過程。

[關(guān)鍵詞] 骨性關(guān)節(jié)炎；長鏈非編碼RNA母系表達基因3；血管內(nèi)皮生長因子；相關(guān)性

[中圖分類號] R684.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（a）-0008-05

[Abstract] Objective To determine the expressions of long non-coding RNA MEG3 （lncRNA MEG3） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in the articular cartilage tissues of osteoarthritis （OA）， and to analyze the correlation between the lncRNA MEG3 and VEGF. Methods The knee articular cartilage tissues from 40 cases of primary OA and 20 healthy volunteers were collected from January 2014 to December 2015 in Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region. After the safranin O staining， the OA patients were grouped according to the improved score criterion of Mankin. Real-time PCR assay was applied to detect the expressions of lncRNA MEG3 and VEGF mRNA in the knee articular cartilage tissues， and the ELISA assay was utilized to determine the protein level of VEGF. The correlation between the lncRNA MEG3 and VEGF was analyzed by the Pearson. Results The real-time PCR results showed that compared to the normal articular cartilage tissues， the lncRNA MEG3 was significantly downregulated in the OA articular cartilage tissues （P < 0.05）， and the higher degree of degradation， the lower of lncRNA MEG3 （P < 0.05）. Moreover， the mRNA and protein levels of VEGF were significantly upregulated in the OA articular cartilage tissues （P < 0.05）， and the higher degree of degradation， the higher of VEGF （P < 0.05）. The Pearson results showed that there was a negative relationship between the lncRNA MEG3 and VEGF （r = -0.466， P < 0.05）. Conclusion lncRNA MEG3 was decreased in the articular cartilage tissues of OA， and lncRNA MEG3 was negatively correlated with the VEGF. lncRNA MEG3 may be involved in primary OA development through the regulation of angiogenesis.

[Key words] Knee osteoarthritis； Long non-coding RNA MEG3； Vascular endothelial grouth factor； Correlation

據(jù)調(diào)查統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，約50%的65歲以上老年人患有骨關(guān)節(jié)炎（OA），其中以原發(fā)性膝關(guān)節(jié)性O(shè)A最常見[1]。在中國，隨著人口老齡化的加劇，OA逐漸成為一個主要的公共健康問題。迄今為止，OA的發(fā)病機制并未完全闡明，缺乏確切的有效治療方法。因此，尋找能夠預防OA發(fā)生、指導治療方案選擇和減輕OA癥狀的新生物靶標，是臨床亟需解決的問題。目前，公認與OA發(fā)生密切相關(guān)的兩大因素是炎癥和血管生成，靶向滑膜血管生成可能成為減輕疾病癥狀、OA治療方案選擇的研究方向[2]。

非編碼RNA（ncRNA）是一類不具有蛋白編碼的能力的RNA分子[3]。根據(jù)分子大小，ncRNA可分為兩大類，即微小RNA（microRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）[4-5]。研究表明，microRNA在OA發(fā)生和進展中存在異常表達，且影響軟骨的完整性[6]；此外，已有研究證實，lncRNA在骨和軟骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[7]。lncRNA具有作為OA疾病診斷和治療分子靶標的潛能[8]。MEG3基因位于染色質(zhì)14q32.3，屬于抑癌基因[9]，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為lncRNA。lncRNA MEG3可能通過抑制血管生成，阻礙腫瘤惡性進展[10]。而關(guān)于lncRNA MEG3在OA發(fā)生和進展中的作用，相關(guān)研究甚少。本研究檢測原發(fā)性膝關(guān)節(jié)性O(shè)A患者和健康志愿者軟骨組織中l(wèi)ncRNA MEG3表達情況，并分析lncRNA MEG3表達與VEGF表達之間的關(guān)系，以期為OA臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月～2015年12月在新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院（以下簡稱“我院”）住院部確診為原發(fā)性膝關(guān)節(jié)性O(shè)A，且行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)或關(guān)節(jié)清理術(shù)的40例患者自愿捐贈的軟骨組織，其中男21例，女19例；年齡50～78歲，平均（59.43±8.32）歲；左側(cè)27例，右側(cè)13例。診斷標準：根據(jù)中華醫(yī)學會制訂的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2007年版）》[11]中膝關(guān)節(jié)性O(shè)A的診斷標準，即膝關(guān)節(jié)疼痛、發(fā)僵、關(guān)節(jié)活動明顯受限；反復勞損或創(chuàng)傷史；膝關(guān)節(jié)屈伸活動時，可捫及摩擦音；膝關(guān)節(jié)正、側(cè)位照片，顯示髕骨、股骨髁、脛骨平臺關(guān)節(jié)緣呈唇樣骨質(zhì)增生，脛骨髁間隆起變尖，關(guān)節(jié)間隙變窄。納入標準：原發(fā)性O(shè)A并行膝關(guān)節(jié)置換者；近6個月無服用抗炎藥物、激素等。排除標準：服用免疫抑制劑等；既往有膝關(guān)節(jié)手術(shù)史；創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、化膿性關(guān)節(jié)炎和類風濕關(guān)節(jié)炎等其他類型的關(guān)節(jié)炎。取同期20例創(chuàng)傷后行截肢術(shù)、膝關(guān)節(jié)內(nèi)游離軟骨塊行關(guān)節(jié)鏡取出術(shù)患者自愿捐贈的正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織作為對照，其中男13例，女7例；年齡50～71歲，平均（58.68±9.45）歲；左側(cè)9例，右側(cè)11例。對照組納入標準：既往無關(guān)節(jié)疼痛、僵硬腫脹及活動受限的病史；患者及其家族中均無骨、關(guān)節(jié)代謝性疾病病史；膝關(guān)節(jié)的影像學檢查無異常；術(shù)中對關(guān)節(jié)軟骨進行大體觀察排除退行性改變并且評分為正常。兩組患者在年齡、性別方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（t = 0.315， χ2=0.848， P < 0.05）。將所獲得軟骨組織分成兩份：一份置于中性甲醛內(nèi)，用于組織學檢查；另一份取出后立即置于液氮中保存，用于分子生物學檢測。所有患者均具有完整的病歷資料，簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院倫理委員會審核同意。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑與儀器 番紅O溶液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑、RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Invitrogen公司，real-time PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司。

超微量核酸蛋白測定儀（ND2000，美國Thermo公司）、定量PCR擴增儀（7500，美國ABI公司）、酶標儀（ELX800，美國Bio-Tek儀器有限公司）。

1.2.2 組織學染色及改良Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分 所有軟骨組織樣本經(jīng)中性甲醛固定后，石蠟包埋，5 μm厚切片；經(jīng)二甲苯脫蠟，在100%、95%、90%、80%的乙醇中浸泡各3～5 min，再放入蒸餾水中3 min；新鮮配制的Weigert染液染色5 min，酸性酒精（1%鹽酸，70%乙醇）中使之分化15 s，蒸餾水沖洗3 min；0.02%堿性孔雀綠水溶液中染色3 min，1%的醋酸中快速漂洗；0.1%的番紅O水溶液中染色1 min，95%乙醇沖洗。脫水，清理，封片。

每個樣本隨機選取10個視野，高倍顯微鏡下進行觀察，按照改良Mankin病理評分標準對關(guān)節(jié)軟骨病理程度進行評分，該評分范圍為0～14分，分組標準如下，正常組：0～1分；輕度退變組：2～5分；中度退變組：6～9分；重度退變組：10～14分。分值越大代表關(guān)節(jié)退變越嚴重。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測lncRNA MEG3和VEGF mRNA相對表達量 Trizol法提取軟骨組織的總RNA，按照RNA提取試劑盒的說明書操作。超微量核酸蛋白測定儀檢測總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆?。實時熒光定量PCR（Real-time PCR）引物序列如下，lncRNA MEG3正向引物5'-3'：CTG CCC ATC TAC ACC TCA CG，反向引物5'-3'：CTC TCC GCC GTC TGC GCT AGG GGC T；VEGF正向引物5'-3'：CCC TGA TGA GAT CGA GTA CAT CTT，反向引物5'-3'：AGC AAG GCC CAC AGG GAT TT；GAPDH正向引物5'-3'：GAA GGT GAA GGT CGG AGT CA，反向引物5'-3'：GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC。定量PCR擴增儀檢測lncRNA MEG3表達水平。Real-time PCR擴增體系為20 μL，反應體系：ddH2O，6 μL；SYBR Green Master Mix，10 μL；正向引物，1 μL；反向引物，1 μL；cDNA，2 μL。反應條件：50℃預熱2 min，95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸55 s，進行35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示lncRNA MEG3和VEGF mRNA的相對表達量。

1.2.4 ELISA法檢測VEGF蛋白表達 取100 mg液氮保存的軟骨組織，置于經(jīng)液氮預冷不銹鋼管；用鋼制小錘在液氮中將組織標本擊碎，研磨至粉狀。粉末置于溶液中（150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris HCl buffer，pH7.4），充分溶解后，48 000 g，4℃，離心60 min，取上清，VEGF的ELISA試劑盒進行檢測，實驗重復3次后，進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨組織的Mankin評分和分組

采用番紅O溶液對軟骨組織進行染色，改良的Mankin評分標準對OA關(guān)節(jié)軟骨進行分組，結(jié)果顯示，本研究中40例OA患者分為輕度退變組11例，中度退變組18例和重度退變組11例。組間Mankin評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 lncRNA MEG3在OA軟骨組織中的表達情況

lncRNA MEG3在OA軟骨組織中的相對表達量顯著低于正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織，而且隨著OA軟骨退化程度的提高，lncRNA MEG3的表達含量逐步降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 VEGF表達在OA軟骨組織中的表達情況

Real-time和ELISA試驗結(jié)果顯示，VEGF mRNA和VEGF蛋白在OA軟骨組織中的相對表達量均顯著高于正常軟骨組織，且隨著OA軟骨退化程度的提高，VEGF mRNA和VEGF蛋白的表達含量逐步增加，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3。

2.4 lncRNA MEG3表達與VEGF表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示，在OA軟骨組織中，lncRNA MEG3表達與VEGF表達之間存在線性相關(guān)（r = -0.466，P = 0.002）。見圖1。

3 討論

膝關(guān)節(jié)是人體最復雜、活動最頻繁的骨骼結(jié)構(gòu)，其骨端覆蓋一層厚1～5 mm的關(guān)節(jié)軟骨，由軟骨細胞、纖維和基質(zhì)組織構(gòu)成，關(guān)節(jié)軟骨中缺少血液和淋巴供應，主要由關(guān)節(jié)腔內(nèi)的關(guān)節(jié)液體提供養(yǎng)分。膝關(guān)節(jié)性O(shè)A最主要的改變是關(guān)節(jié)軟骨的退化，這也是造成關(guān)節(jié)疼痛的主要原因[1-2]。

近年來，在OA的病因、發(fā)病機制和治療等方面的研究取得了較大進展，但目前OA的治療以保守治療為主，如使用非甾體抗炎藥（NSAIDs）止痛，康復訓練來改善關(guān)節(jié)功能，待病情發(fā)展至晚期，則只能通過人工關(guān)節(jié)置換[12]。晚期OA患者大多伴有糖尿病、高血壓等心腦血管疾病，關(guān)節(jié)置換手術(shù)風險大，并發(fā)癥發(fā)生率高，且費用昂貴。因此，闡明OA發(fā)病機制，尋找能夠延緩軟骨退變的方法，是臨床亟需解決的問題。

MEG3是一種印跡基因，定位于染色質(zhì)14q32.3，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為lncRNA，而并非蛋白質(zhì)。MEG3基因在人類多種組織中表達，可在卵巢、乳腺、胰腺和肝臟等組織中檢測到MEG3基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而MEG3在胎盤、腦和腺垂體中高表達。目前發(fā)現(xiàn)的MEG3轉(zhuǎn)錄本共有27個，Zhang等[13]在人胎兒肝cDNA文庫篩選出了多個MEG3亞型基因，并且發(fā)現(xiàn)這些MEG3亞型基因有相同的功能，如刺激p53介導的激活能力，抑制腫瘤生長等，提示MEG3亞型基因具有相似功能。因此，本研究采用能夠檢測所有MEG3剪切體的引物，檢測MEG3在OA軟骨組織中的表達水平。

研究發(fā)現(xiàn)，在多種類型的人類腫瘤細胞中都存在MEG3基因表達缺失，提示MEG3具有作為抑癌基因的能力，MEG3基因表達缺失對腫瘤形成和惡性進展起促進作用。外源性增加MEG3基因表達，顯著抑制了腫瘤細胞的集落形成和錨定非依賴型生長能力[14]，證實MEG3能夠抑制腫瘤細胞的增殖。

目前，關(guān)于lncRNA MEG3在OA疾病發(fā)生和軟骨退變中的功能的研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，在OA軟骨組織中，lncRNA MEG3表達下降，且隨著OA嚴重程度的提高，lncRNA MEG3的表達含量逐步降低，提示MEG3表達丟失可能促進了OA發(fā)生和進展。

此外，Gordon等[10]在MEG-null小鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)，與血管生成途徑相關(guān)基因的表達增加，血管內(nèi)皮生長因子α（VEGFA）及其Ⅰ型受體（VEGFR1）表達顯著增加，提示敲除MEG3基因可能促進了血管生成。VEGFA和VEGFR1是血管生成的主要調(diào)節(jié)劑，同時新的血管生成是誘發(fā)OA所必需的。因此，MEG3失活導致的血管生成可能是其促使OA進展的機制之一。

有研究結(jié)果提示，血管生成是導致關(guān)節(jié)軟骨損傷，誘發(fā)OA的關(guān)鍵因素[15]。VEGF具有調(diào)節(jié)肥大軟骨重塑、骨化和生長板軟骨血管侵襲的作用[16]。正常軟骨中無血管，而血管侵襲至軟骨，是骨化的第一個關(guān)鍵步驟，并且脈管系統(tǒng)為募集參與軟骨吸收和骨沉積相關(guān)細胞提供了通道[17]。

為了檢測在OA中MEG3和VEGF表達之間的關(guān)系，本研究采用Real-time PCR和ELISA試驗檢測VEGF的表達水平。與正常軟骨組織相比，VEGF mRNA和VEGF蛋白在OA軟骨組織中表達顯著增加，且隨著OA軟骨退化程度的提高，VEGF mRNA和VEGF蛋白的表達含量逐步增加，提示VEGF可能通過促進軟骨血管生成從而促進OA進展。

本研究進一步分析了OA軟骨組織中，lncRNA MEG3表達與VEGF表達之間是否具有相關(guān)性。Pearson線性分析結(jié)果顯示，lncRNA MEG3與VEGF之間呈負相關(guān)，提示MEG3失活，增強的血管生成，是促進OA進展的機制之一。

而MEG抑制血管生成的具體機制尚不明確。有研究顯示lncRNA MEG3能夠激活p53介導的轉(zhuǎn)錄激活[18-19]。p53能夠通過結(jié)合至VEGF啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子Sp1負調(diào)控VEGF轉(zhuǎn)錄[20]。因此，lncRNA MEG3表達丟失，可能導致了p53活性降低，進而增強了VEGF轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果提示，MEG3可能是通過p53通路介導的血管生成抑制作用，以及抑制VEGF表達。也有研究提示，lncRNA MEG3可通過非依賴p53的通路發(fā)揮作用[21]，本研究將在后續(xù)研究中對lncRNA MEG3調(diào)節(jié)VEGF表達的具體機制進行深入探討。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，lncRNA MEG3在原發(fā)性O(shè)A軟骨組織中表達顯著下降，且lncRNA MEG3表達與VEGF表達之間負相關(guān)，提示lncRNA MEG3參與原發(fā)性O(shè)A的發(fā)生過程，可能是通過調(diào)節(jié)血管生成實現(xiàn)的。

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