NLRP3炎性小體對冠心病患者血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平的影響*

胡龍江，周音頻△，曹運蘭，呂 湛，藍運競，寧 琳，向立權，肖 鵬

(1.重慶市涪陵中心醫(yī)院心血管內(nèi)科 408000；2.貴州省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴陽 550002；3.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川南充 637000)

隨著人民生活水平的不斷提高，心血管疾病的發(fā)病率逐年增加，特別是在發(fā)達國家及部分發(fā)展中國家。因此，進一步明確心血管疾病的發(fā)病機制及尋找新的心血管疾病防治策略迫在眉睫。有研究表明，局部和全身炎癥反應及自身免疫在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[1]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 (NLRP3)炎性小體是一種包含NLRP3、凋亡相關微粒蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的蛋白質(zhì)復合體,在機體正常免疫反應過程中起重要作用，是炎癥-免疫的橋梁，在心血管疾病中的作用是當前研究的熱點[2-3]，它能促進炎性因子白細胞介素(IL)-1β、IL-18的產(chǎn)生[4]，參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，而當IL-1β、IL-18作為炎性因子參與機體炎癥反應，機體抗炎因子如TGF-β亦會發(fā)生相應變化。本研究通過檢測冠心病患者外周血單個核細胞(PBMCs)中NLRP3炎性小體的表達情況及血漿IL-1β、IL-18、轉化生長因子-β(TGF-β)的水平變化，進一步探討NLRP3炎性小體與冠心病發(fā)生發(fā)展的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年3-9月重慶市涪陵中心醫(yī)院健康體檢中心的健康體檢者30例(對照組)，心血管內(nèi)科收治的冠心病患者60例(冠心病組)，年齡均在40～80歲，對照組肝、心、腎、肺檢查均正常，排除自身免疫性疾病、代謝性疾病、急慢性感染性疾病、近期創(chuàng)傷、腫瘤、正在使用抗炎藥物者，排除有遺傳病及傳染病家族史者。冠心病組符合患冠心病診斷依據(jù)(行冠狀動脈造影術證實)，排除移植血管病變者，排除嚴重心、肝、腎功能不全等慢性并發(fā)癥者，余排除標準同對照組。該研究獲重慶市涪陵中心醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1基本臨床資料采集 研究對象入組后，統(tǒng)計性別、年齡、吸煙史、平均動脈壓(MAP)、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、空腹血糖(FPG)、血脂等臨床資料，所有研究對象入組后次日06:00時抽取外周靜脈血20 mL，取4 mL全血離心，抽取血漿，置于-80 ℃冰箱中備用，剩余全血，注入肝素抗凝管，F(xiàn)icoll-Hypaque密度梯度分離出PBMCs。

1.2.2RNA提取及逆轉錄 采用RNAiso plus試劑盒提取人PBMCs總RNA，測定其濃度并檢測純度。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit進行逆轉錄合成cDNA，引物序列由TaKaRa公司合成，見表1。

1.2.3RT-qPCR反應 應用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒進行實時定量PCR反應，反應體系及條件參照說明書，反應結束后，作擴增及溶解曲線，采用Ct值計算目的基因的相對表達量：ΔΔCt=(Ct病例組-CtGAPDH)-(Ct對照組-CtGAPDH)，病例組目的基因mRNA的相對表達量=2-ΔΔCt。

1.2.4Western blot 按照Western blot及IP細胞裂解液提取PBMCs總蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白進行8%SDS-PAGE凝膠電泳，裁膜，轉膜，BSA-TBS封閉液封閉4 h，浸入含蛋白NLRP3(1∶100)、ASC(1∶1 000)，caspase-1(2.5 μg/mL)、內(nèi)參蛋白GAPDH(1∶500)的一抗稀釋液中，在 4 ℃孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)，在室溫孵育1 h，洗膜，凝膠成像分析系統(tǒng)顯影分析。

1.2.5ELISA檢測 應用ELISA法測定血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平，嚴格參照說明書進行操作。

2 結 果

2.1兩組基本資料及血脂、血糖水平比較 兩組性別、吸煙、年齡、BMI、FPG、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDLC)、差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；MAP在冠心病組高于對照組，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)在對照組高于冠心病組(P<0.05)，見表2。

2.2兩組血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化比較 IL-1β、IL-18、TGF-β在冠心病組高于對照組(P<0.05)，見表3。

2.3兩組NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA水平比較 PBMCs中ASC mRNA在冠心病組中的表達高于對照組(P<0.05)，見圖1。

表1 引物序列

表2 兩組間基本情況及血脂、血糖水平變化比較

表3 兩組血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化比較

*：P<0.05，與對照組比較

圖1兩組NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA水平比較

2.4兩組NLRP3、ASC、caspase-1水平比較 PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1在冠心病組中的表達高于對照組(P<0.05)，見圖2、3。

*：P<0.05，與對照組比較

圖2兩組NLRP3、ASC、caspase-1蛋白水平比較

圖3 兩組Western blot檢測結果

2.5兩組NLRP3、ASC、caspase-1及其mRNA與其余各觀察指標相關分析 對照組caspase-1 mRNA與FPG呈正相關(r=0.394，P=0.031)，NLRP3與性別呈正相關(r=0.429，P=0.020)，ASC與FPG呈正相關(r=0.405，P=0.026)，caspase-1與MAP、FPG呈正相關(r=0.447、0.396，P=0.013、0.030)；冠心病組，NLRP3 mRNA和caspase-1 mRNA均與IL-18呈正相關(r=0.327、0.274，P=0.011、0.031)，ASC與年齡、IL-1β、IL-18呈正相關(r=0.370、0.467、0.403，P=0.024、0.009、0.027)；caspase-1與吸煙、IL-18呈正相關(r=0.613、0.414，P<0.01,P=0.023)。

2.6IL-1β、IL-18、TGF-β之間相關分析 Spearman相關分析顯示IL-1β、IL-18、TGF-β在對照組無相關性；而在冠心病組，IL-1β與TGF-β呈負相關(r=-0.287，P=0.026)。

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種慢性、漸進性炎性疾病，炎癥反應在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及粥樣斑塊的破裂、繼發(fā)性血栓的形成過程中發(fā)揮著重要作用。在冠心病患者中，粥樣硬化斑塊是貫穿于冠心病的關鍵點。同樣，炎性反應促進冠心病的發(fā)生發(fā)展及急性冠狀動脈綜合征的發(fā)生。NLRP3炎性小體具有調(diào)控機體慢性炎癥反應的功能，NLRP3 是其最核心的組成部分，包括中間的核苷酸寡聚結構域、C 端的亮氨酸重復序列及N 端的熱蛋白結構域，ASC是其銜接蛋白，與NLRP3 及caspase-1前體結合，并介導NLRP3激活caspase-1，而caspase-1 是其效應蛋白，它被激活后促使促炎因子如IL-1β和L-18的前體轉化為活性形式[4-5]。

IL-1β 是經(jīng)典的炎性因子，參與動脈粥樣硬化相關的免疫與炎性反應，在冠心病的發(fā)生發(fā)展及斑塊的破裂過程中起著重要作用[6]，其機制包括：促進血管平滑肌細胞遷移及增殖[7]；促進血管內(nèi)皮細胞增生及細胞外基質(zhì)沉積；促進泡沫細胞形成；上調(diào)CD40 及其配體的表達[8]；促進免疫反應及免疫調(diào)節(jié)；促進動脈血栓形成。

IL-18是“多效能”炎性因子，在免疫及炎性反應過程中扮演著重要角色，它不僅通過誘導INF-γ的生成；誘導血管平滑肌細胞的增殖和遷移及血管內(nèi)皮細胞的凋亡；促進泡沫細胞的形成；刺激血管壁細胞IL-1β、IL-8等細胞因子的表達；促進單核巨噬細胞基質(zhì)金屬蛋白酶的表達及凋亡等機制促進冠心病的發(fā)生發(fā)展，而且增加動脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性[9]，促進易損斑塊的形成，參與易損斑塊的潰瘍、破裂、血栓的形成[10]。IL-18是冠心病的獨立危險因子，并可對冠心病患者病情的發(fā)展及嚴重冠脈事件作出預測[11-12]。

TGF-β是具有多種生物學功能的多肽生長因子，在心血管系統(tǒng)中亦起重要作用。TGF-β具有抑制炎性反應的作用，而在動脈粥樣硬化疾病中，TGF-β在機體過度表達，其通過多種途徑使其對機體有利的生物學作用降低[13]，反而通過促進平滑肌細胞的增生、遷移、分化[14-15]；促進細胞外基質(zhì)的合成與積聚，抑制細胞外基質(zhì)的降解[13-14]；誘導血管重構[13-14]；促進血栓形成[14]；增加纖維帽厚度等機制促進冠心病的發(fā)生發(fā)展。

本課題組通過檢測PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)對照組PBMCs中ASC mRNA水平顯著低于冠心病組，提示NLRP3 炎性小體在患者病患者中部分組分在轉錄水平即表達增加，為冠心病患者激活NLRP3 炎性小體奠定了基本條件。雖然NLRP3 及caspase-1 mRNA的表達在冠心病患者中未見明顯增高，但均與IL-18呈正相關，提示NLRP3炎性小體在轉錄水平即有促進炎性因子IL-18表達的傾向。本課題組進一步提取PBMCs中總蛋白，并檢測NLRP3炎性小體各組分濃度，同時測定IL-1β、IL-18、TGF-β在血漿中的水平，發(fā)現(xiàn)冠心病患者中NLRP3、ASC、caspase-1濃度及血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平均高于對照組(P<0.05)，提示PBMCs中NLRP3炎性小體以及血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關；且ASC在冠心病組與年齡、IL-1β、IL-18呈正相關，caspase-1在冠心病組與吸煙、IL-18呈正相關，IL-1β在冠心病組與TGF-β呈負相關，提示在冠心病患者中，發(fā)揮正常免疫功能的NLRP3 炎性小體的調(diào)控失去平衡性，它被激活后，導致促炎細胞因子IL-1β 、IL-18 過量生成，繼而通過下游的信號轉導通路產(chǎn)生炎性瀑布反應，導致冠狀動脈炎性損傷。但在冠心病患者中，促炎因子IL-1β 和IL-18的表達并未直接促進抗炎因子TGF-β的表達，冠心病患者血漿TGF-β的高表達，與其他途徑密切相關，本課題組將進一步研究。

綜上所述，PBMCs中NLRP3炎性小體以及血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關，以NLRP3炎性小體為中心的NLRP3-ASC-caspase-1-IL-1β/IL-18信號通路可能在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但該通路并未促進冠心病患者抗炎因子TGF-β的表達，血漿TGF-β高表達可能與其他途徑密切相關。因此，進一步研究NLRP3-ASC-caspase-1- IL-1β/IL-18信號通路以及TGF-β的激活及調(diào)控機制，進而針對該通路及TGF-β的干預有可能成為防治冠心病潛在而有效的策略。