膠原蛋白海綿對拔牙創(chuàng)愈合過程中基因ALP表達的影響*

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(1.山東省口腔組織再生重點實驗室，山東 濟南 250012；2.山東大學口腔醫(yī)學院，山東 濟南 250012；3.泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科，山東 泰安 271000；4.泰山醫(yī)學院口腔醫(yī)學院，山東 泰安 271000)

牙槽骨的骨量及位點保存是種植義齒修復最為關鍵的工作，如何預防拔牙后牙槽嵴吸收，保證拔牙后有足夠的骨量來進行種植牙尤為重要[1]。而且拔牙術后牙槽窩骨愈合較慢，嚴重影響患者對美觀及早期功能恢復的要求。因而，探索一種簡便操作，可有效減少骨吸收，縮短修復等待時間的方法極為迫切。膠原蛋白海綿有良好的生物相容性、較強的止血效果及吸附功能，便于局部沉積鈣離子和磷酸根離子，能為拔牙后骨腔的血塊凝集提供足夠的立體空間，可有效地促進成骨。目前臨床中普遍采用膠原蛋白海綿填塞頜骨囊腫手術后的骨腔及埋伏牙骨腔取得良好的止血效果，同時囊腔成骨速度也明顯提高[2]。關于膠原蛋白海綿促進牙槽窩愈合的實驗研究相繼被報道，但缺乏基因水平研究[3]。本實驗旨在研究膠原蛋白海綿植入對牙槽窩組織成骨相關基因ALP的早期表達水平變化的影響，進一步從分子水平為膠原蛋白海綿的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物和材料

健康雌性SD大鼠16只，4周齡，體重約(250±12.5)g左右，飼養(yǎng)于泰山醫(yī)學院動物實驗中心，口腔檢查無疾患，飲食活動正常。膠原蛋白海綿采用倍菱牌，購自北京益而康生物開發(fā)中心。

1.1.2主要試劑及設備

實時定量PCR試劑盒qPCR Mix (Bio-Rad公司)，反轉錄酶試劑盒 Goscript (購自 Promega 公司)，RNA提取應用Trizol試劑盒(購自Generay生物公司)。武漢塞維爾科技有限公司合成ALP基因，上游引物：5'-GGATCAAAGCAGCATCTTACCAG-3'，下游引物：5'-GCTTTCCCATCTTCCGACACT -3'；GADPH基因上游引物：5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游引物：5'-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3'。主要設備定量PCR儀為Stepone plus (ABI,美國)，臺式高速冷凍型微量離心機D3024R (DragonLab,中國)。

1.2 方法

1.2.1動物模型建立

用10%水合氯醛將SD大鼠麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，術區(qū)采用碘伏消毒，分離右側上頜第一磨牙牙齦，用口腔探針的三彎端從上頜第一磨牙腭側插入根分叉，輕輕撬動，直至牙齒松動脫位，將膠原蛋白海綿放入牙槽窩，至骨水平，縫合固定。左側為對照側，同法拔除上頜第一磨牙，復位縫合，縫線均采用5-0可吸收縫線，均縫合一針。注意觀察大鼠呼吸，避免窒息。老鼠術后復蘇良好，飲食活動正常。分別在術后1周、2周、4周、8周各處死老鼠4 只，取老鼠拔牙窩的牙槽骨及肉芽組織，進行基因檢測。

1.2.2實時定量PCR檢測成骨相關基因ALP表達

按照試劑盒操作步驟，對樣本進行RNA提取，反轉錄后得到cDNA，置于冰箱，-20 ℃保存。之后運用實時定量PCR法測定ALP基因表達情況。采用2-△△CT法計算實驗組與對照組ALP基因的表達差異。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

ALP基因在實驗側組織及對照側組織中均有表達，術后1周、2周、4周、8周，實驗側組織中ALP基因表達相對定量分別為(6.41±0.63)，(10.76±0.46)，(4.46±0.65)，(1.75±0.45)，均顯著高于對照側組織(P<0.05)，術后ALP基因相對定量分析結果見表1。

表1 術后基因ALP表達的定量PCR分析結果

3 討 論

拔牙創(chuàng)的愈合實際上是一個骨組織的修復再生的動態(tài)過程，該過程較慢，通常拔牙術后需要3個月之久新生骨才能達到吸收的牙槽嵴頂水平[1]，因此預防拔牙后牙槽嵴吸收，加速骨組織的修復再生過程，對于各種后續(xù)牙科操作具有重要的臨床意義。 目前國內外關于如何避免拔牙后牙槽骨吸收的研究越來越受到關注。Wang等[4]主要從微創(chuàng)拔牙、處理牙槽窩骨壁獲得充足血液、骨移植材料填入牙槽窩內2/3深度、創(chuàng)傷敷料填充剩1/3深度、8字縫合牙槽窩、應用卵圓形義齒幫助牙齦成形。Fowler等[5]推崇“Bio-Col technique”技術，也是在微創(chuàng)拔牙的基礎上，固有牙槽骨壁鑿孔出血，Bio-oss充填，放置 Collaplug縫合等。而Landsberg[6]通過采用拔牙窩內骨移植及拔牙窩頂軟組織移植的牙槽窩封閉術進行臨床試驗，取得了良好效果。2009年Simon等[7]對自體富血小板纖維蛋白基質的研究發(fā)現(xiàn)植入自體富血小板纖維蛋白基質的牙槽窩愈合速度更快，即使不用生物膜也能取得較好的效果。生物膜的應用對拔牙后骨缺損病例進行植骨蓋膜，可有效促進缺損骨修復。Lasella等[8]對異種骨加膠原膜進行牙槽骨保存的實驗，術后7個月，實驗組成骨比例明顯高于對照組。盡管這些研究取得了明顯效果，可是因手術的復雜性、植入材料及生物膜的高昂價格等諸多因素限制，難以在臨床廣泛應用。

膠原是動物體內含量最多的蛋白質，也是器官中結締組織的主要成分。研究表明，膠原和其他蛋白質相比不易引起抗體產生，所有從哺乳動物分離提取的Ⅰ型膠原非常相似，因而不易被人體免疫系統(tǒng)作為外體識別。膠原蛋白海綿在體內可以降解成無毒天然產物。再者，膠原蛋白海綿具有易于加工、滅菌和保存等獨特的優(yōu)勢，被視為最有用途的生物材料，早已廣泛應用于止血、組織缺損充填修復以及組織工程支架等領域[9-11]。膠原蛋白是骨組織主要成分之一，可加速骨修復，它能夠為組織鈣化提供必需的的三維結構，而且位于其表面的骨鈣素結合位點，對礦物沉積有一定誘導作用，可促進新骨的形成[8]。朱曉琴等[3]通過建立兔拔牙模型，通過骨密度檢測和組織學檢查初步證實膠原蛋白海綿填入拔牙創(chuàng)能促進牙槽窩的早期骨愈合。本實驗在其研究基礎之上，運用實時定量PCR技術進一步探討膠原蛋白海綿填入拔牙創(chuàng)后促進牙槽窩早期骨愈合的分子機制。通過建立大鼠拔牙模型，選取拔牙術后 1、2、4、8周作為研究時間點，實時定量PCR檢測成骨相關基因 ALP的表達，發(fā)現(xiàn)拔牙后填充膠原蛋白海綿的實驗側組織ALP表達上調，該結果與目前文獻中報道的成骨誘導劑處理拔牙創(chuàng)組織相關成骨基因表達水平變化較為一致。

綜上，本研究從分子水平證實膠原蛋白海綿填塞拔牙創(chuàng)后ALP基因顯著上調，促進成骨效果明顯，為探索膠原蛋白海綿促進成骨的機制研究提供了初步的參考資料，本課題計劃未來采用基因芯片技術進一步探索膠原蛋白海綿填充對于拔牙創(chuàng)愈合過程中相關基因的表達變化情況，深入探索膠原蛋白海綿促進成骨的分子機制。