慢性心力衰竭患者血漿長鏈非編碼核糖核酸XIST的表達(dá)及臨床意義

韓虎魁，李剛，李其勇，陳勇，田文杰，李進(jìn)嵩，黃浩，陶劍虹

方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)我院收治的90例CHF患者（CHF組）及40例健康體檢者（對(duì)照組）血漿LncRNA XIST的表達(dá)，分析血漿LncRNA XIST表達(dá)水平與B型利鈉肽（BNP）、左心室射血分?jǐn)?shù)等臨床參數(shù)之間的相關(guān)性；用受試者工作特征曲線分析LncRNA XIST對(duì)CHF的預(yù)測(cè)作用；用Kaplan Meier生存分析LncRNA XIST對(duì)CHF患者1年生存率的影響；用多因素COX回歸分析影響CHF患者預(yù)后的因素。

結(jié)果：與對(duì)照組比較，LncRNA XIST在CHF組患者中的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。血漿LncRNA XIST的表達(dá)與BNP水平呈正相關(guān)（r=0.685，P=0.001），與左心室射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.618，P=0.002）。血漿LncRNA XIST診斷CHF的效率為0.854（95%CI：0.795～0.932，P＜0.001）。LncRNA XIST高表達(dá)患者的1年平均生存時(shí)間短于LncRNA XIST低表達(dá)者[（5.38±1.22）個(gè)月 vs（10.35±1.98）個(gè)月]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.98，P＜0.001）。多因素COX回歸分析顯示，LncRNA XIST高表達(dá)是CHF患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（HR=3.370，95%CI：1.730～6.550，P＜0.001）。

結(jié)論：血漿LncRNA XIST高表達(dá)與CHF有一定的相關(guān)性，高表達(dá)LncRNA XIST與CHF患者的預(yù)后較差有關(guān)。

慢性心力衰竭（CHF）是心血管疾病的常見并發(fā)癥，其發(fā)病率逐年上升，正日益威脅著人們的身體健康[1]。早期正確診斷和狀態(tài)評(píng)價(jià)有助于采用合理治療并降低心力衰竭（HF）患者的死亡率，但目前缺乏有效的早期診斷及預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物[2]。長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）是一類內(nèi)長度超過200 nt的功能性RNA，位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿，在真核細(xì)胞內(nèi)被普遍轉(zhuǎn)錄，但不具有或很少有蛋白編碼功能[3]。近年來的研究表明，LncRNA參與人類許多疾病的發(fā)生、發(fā)展，如癌癥、HELLP綜合征和短指綜合征。然而，LncRNA在HF患者中的研究報(bào)道較少[4-6]。前期通過基因芯片發(fā)現(xiàn)，LncRNA X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本基因（X-inactive specific transcript，XIST）在CHF患者血漿中的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，提示LncRNA XIST可能參與和調(diào)節(jié)CHF的發(fā)生、發(fā)展。本研究旨在研究LncRNA XIST在CHF患者血漿中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響。

1 資料與方法

研究對(duì)象：入選2014-01至2017-01在我院心血管內(nèi)科經(jīng)臨床確診的CHF患者90例為CHF組。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合CHF診斷標(biāo)準(zhǔn)或有左心室擴(kuò)大、左心室射血分?jǐn)?shù)降低；（2）有明確導(dǎo)致HF的基礎(chǔ)疾病；（3）年齡＞18歲，性別不限；（4）正規(guī)抗HF治療不少于1個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）惡性腫瘤性疾病或嚴(yán)重感染性疾病、器官移植病史、急性失代償性HF；（2）入選前1個(gè)月內(nèi)發(fā)生急性冠狀動(dòng)脈事件（不穩(wěn)定性心絞痛、急性ST段抬高型心肌梗死、急性非ST段抬高型心肌梗死）；（3）血肌酐 ＞2.5 mg/ml；（4）已有文獻(xiàn)報(bào)道的會(huì)對(duì)循環(huán)LncRNA XIST水平造成影響的情況。另選擇健康對(duì)照受試者40例為對(duì)照組。對(duì)照組經(jīng)詳細(xì)問診、查體及實(shí)驗(yàn)室檢查，排除器質(zhì)性心臟疾病及其他系統(tǒng)的急、慢性疾病和已知會(huì)對(duì)LncRNA XIST表達(dá)造成影響的疾?。恍碾妶D無異常，超聲心動(dòng)圖排除心臟結(jié)構(gòu)和心功能異常。所有研究者均簽署知情同意書, 經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

一般實(shí)驗(yàn)室檢查：兩組受試者在入院時(shí)接受血漿B型利鈉肽（BNP）以及肝、腎功能等相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

血漿總RNA提?。簝山M受試者均采集清晨空腹肘靜脈血5 ml，即刻用含抗凝劑的紫色采血管采集靜脈血靜置于4℃冷藏30 min后，室溫下3000 rpm離心15 min，留取上層血漿，置于-80℃冰箱備用。將分離所得血漿，置于冰上融化；取250 μl血漿樣品，加入750 μl Trizol（RNA抽提試劑），振蕩器混勻，靜置5 min；加入200 μl氯仿，振蕩器混勻，靜置10 min；室溫下離心12 000 rpm、10 min，留取上清液并量取其體積，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無 核糖核酸酶（Rnase）的EP管中；分別加入與上清液等體積的異丙醇，振蕩器振蕩混勻，室溫下靜置3 min；室溫下離心12 000 rpm、10 min；倒出管內(nèi)液體，加用1 ml 75%乙醇；室溫12 000 rpm離心2 min；倒出乙醇，并用Tip槍頭將剩余液體吸干凈，晾干。每管中加入10 μl無Rnase的雙蒸水（ddH2O），以能夠充分溶解RNA；用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度及純度。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析LNCRNA XIST的表達(dá)水平：提取血漿總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在20 μl體系中加2 μg總RNA進(jìn)行互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）的合成。qRT-PCR采用2x SYBR Green PCR Master Mix試劑，取適量cDNA作為摸板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μl體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)平行樣，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成相應(yīng)上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)在定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。血液標(biāo)本中LncRNA XIST的表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)分析，用 ±s表示；血漿LncRNA XIST與BNP水平的相關(guān)性分析采用線性回歸法；用受試者工作特征（ROC）曲線分析血漿LncRNA XIST表達(dá)水平對(duì)CHF的預(yù)測(cè)能力；用Kaplan-Meier法分析血漿LncRNA XIST表達(dá)水平與患者1年生存時(shí)間的關(guān)系；用多因素COX回歸分析CHF患者預(yù)后的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組受試者的一般資料比較（表1）：CHF組90例患者平均年齡（60.35±13.39）歲，其中男性48例，女性42例；紐約心臟協(xié)會(huì)心功能分級(jí)Ⅰ級(jí)20例，Ⅱ級(jí)23例，Ⅲ級(jí)22例，Ⅳ級(jí)25例。對(duì)照組40例受試者平均年齡（58.95±7.65）歲，其中男性22例，女性18例。兩組受試者在性別、年齡、身高、體重、血門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平、吸煙和高尿酸血癥者比例等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表1 兩組受試者的一般資料比較

表1 兩組受試者的一般資料比較

注：CHF：慢性心力衰竭；AST：門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶

項(xiàng)目 CHF組(n=90) 對(duì)照組(n=40) P值性別(男/女，例) 48/42 22/18 0.860年齡(歲) 60.35±13.39 58.95±7.65 0.170身高(cm) 160.0±15.0 159.0±15.0 0.712體重(kg) 60.0±12.0 57.0±10.0 0.545吸煙[例(%)] 50(55.6) 29(72.5) 0.068 AST(mmol/L) 46.0±13.0 40.0±10.0 0.090 ALT(mmol/L) 49.8±11.0 45.5±13.4 0.099高尿酸血癥[例(%)] 50(55.6) 26(65.0) 0.313

兩組受試者血漿中LNCRNA XIST與BNP水平比較（圖1）：與對(duì)照組比較，CHF組患者的血漿LncRNA XIST及BNP水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為12.69和14.63，P均＜0.001）。

圖1 兩組受試者血漿LncRNA XIST（1A）與B型利鈉肽水平（1B）比較

CHF患者血漿LncRNA XIST與BNP水平的相關(guān)性分析（圖2）：線性相關(guān)分析顯示，CHF患者血漿LncRNA XIST與BNP水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.685，P=0.001）， 與 LVEF呈 負(fù) 相 關(guān) 關(guān) 系（r=-0.618，P=0.002）。

圖2 血漿LncRNA XIST與B型利鈉肽水平（2A）及左心室射血分?jǐn)?shù)（2B） 的關(guān)系

血漿LncRNA XIST水平預(yù)測(cè)CHF的ROC曲線分析結(jié)果（圖3）：ROC曲線分析顯示，作為預(yù)測(cè)CHF的生物標(biāo)志物，血漿LncRNA XIST水平的曲線下面積（AUC）為 0.854（95%CI：0.795～0.932，P＜0.001）。

圖3 血漿LncRNA XIST水平預(yù)測(cè)慢性心力衰竭的受試者工作特征曲線

Kaplan-Meier法分析血漿LncRNA XIST表達(dá)水平與CHF患者1年生存時(shí)間的關(guān)系（圖4）：根據(jù)血漿LncRNA XIST平均表達(dá)水平，90例CHF患者中，44例LncRNA XIST高表達(dá)（≥8.939），其余46例LncRNA XIST低表達(dá)（＜8.939）。Kaplan-Meier分析顯示，LncRNA XIST高表達(dá)患者的1年平均生存時(shí)間[（5.38±1.22）個(gè)月]短于低表達(dá)者[（10.35±1.98）個(gè)月]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.98，P＜0.001）。

圖4 血漿LncRNA XIST表達(dá)水平與慢性心力衰竭患者1年生存時(shí)間的關(guān)系

多因素COX回歸分析CHF患者預(yù)后的影響因素（表2）：分析結(jié)果顯示，LncRNA XIST高表達(dá)是CHF患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（HR=3.370，95%CI：1.730～6.550，P＜0.001）。

表2 多因素COX回歸分析慢性心力衰竭患者預(yù)后的影響因素

3 討論

HF是指心臟不能維持足夠的心輸出量以滿足身體對(duì)代謝的需要和靜脈血回流受阻的狀態(tài)[7]，是許多心血管疾病終末期的表現(xiàn)。研究表明，人群中HF的患病率和發(fā)病率隨著年齡增加而大幅度升高，50歲人群中HF的患病率為1%，80歲年齡段可升至10%，HF的年發(fā)病率在45～54歲人群中為0.2%，而在85～94歲年齡段則為4%[8,9]。我國2000年大樣本調(diào)查結(jié)果表明，HF發(fā)病率為0.9%，隨著年齡增高，HF的發(fā)病率顯著上升[10,11]。HF患者預(yù)后差，死亡率高，其具體的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物尚未完全闡明[12,13]。

LncRNA是一類位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)長度超過200 nt的功能性RNA，在真核細(xì)胞內(nèi)被普遍轉(zhuǎn)錄，但不具有或很少具有蛋白編碼功能。近年來，LncRNA與復(fù)雜疾病發(fā)生之間的關(guān)系備受關(guān)注，人們對(duì)LncRNA在細(xì)胞生物學(xué)中的功能模式展開了一系列研究。最近研究表明，LncRNA的異常表達(dá)與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[14,15]。Wang等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制重組人抗增殖蛋白2（PHB2）的失活，可抑制心肌細(xì)胞凋亡。Wang等[17]為探討心肌肥大細(xì)胞中微小RNA（miR）和LncRNA的作用，使用血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中miR-489表達(dá)量明顯減少。使用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)心肌細(xì)胞中miR-489的表達(dá)量可拮抗Ang Ⅱ?qū)е碌募?xì)胞肥大損傷；進(jìn)一步探索其中的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，LncRNA CHRF可作為miR-489的“內(nèi)源性海綿”，下調(diào)miR-489的表達(dá)水平，從而對(duì)miR-489的靶基因Myd88進(jìn)行調(diào)控，影響心肌細(xì)胞肥大。Leung等[18]為研究AngⅡ?qū)蜣D(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的影響，使用AngⅡ干預(yù)體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞增殖的miR-221和miR-222轉(zhuǎn)錄自LncRNA Ang362，敲除Ang362后miR-221和miR-222表達(dá)下降，血管平滑肌細(xì)胞增殖降低。

LncRNA XIST是哺乳動(dòng)物體內(nèi)X染色體失活的主要調(diào)節(jié)基因，并且XIST基因只能從失活的X染色體中轉(zhuǎn)錄而來[19]。多項(xiàng)研究證實(shí)，XIST在人類細(xì)胞分化、增殖和基因組功能與形態(tài)的維護(hù)方面發(fā)揮重要作用[20-22]。但目前國內(nèi)外尚未見LncRNA XIST在心血管疾病中的作用及機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者比較，LncRNA XIST在CHF患者中的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血漿LncRNA XIST的表達(dá)與BNP水平呈正相關(guān)（r=0.685，P=0.001），與左心室射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.618，P=0.002）；血漿LncRNA XIST水平預(yù)測(cè) CHF 的效率為 0.854（95%CI：0.795～0.932，P＜0.001）；高表達(dá)LncRNA XIST患者的1年平均生存時(shí)間明顯短于LncRNA XIST低表達(dá)者（P＜0.05）。

總之，本研究提示，血漿LncRNA XIST高表達(dá)與CHF有一定的相關(guān)性，高表達(dá)LncRNA XIST與CHF患者的預(yù)后差相關(guān)。