利用SSR熒光標記鑒定玉米雜交種純度的研究

尹祥佳 焦珍珍 趙慧軍 李艷玫 賈國軍 郝 楠 南 銘 李世風 張東峰

（1蘭州職業(yè)技術學院，蘭州730070；2北京通州國際種業(yè)科技有限公司，北京101100；3定西市農(nóng)業(yè)科學研究院，甘肅定西743000；4甘肅省敦煌種業(yè)股份有限公司，酒泉735000）

玉米是第一個成功利用雜種優(yōu)勢的作物，也是利用雜種優(yōu)勢面積最大的作物[1]。2017年我國玉米播種面積3544.5萬 hm2，總產(chǎn)量2158.9億kg[2]，成為近10年來種植面積和產(chǎn)量增加最多、最快的農(nóng)作物[3]，播種面積和產(chǎn)量均居我國四大作物之首。國內(nèi)90%以上的玉米生產(chǎn)用種是單交種[4]，近年來國內(nèi)玉米新品種種類較多，2017年就有國審玉米品種171個，國家完成統(tǒng)一試驗程序的品種302個，聯(lián)合體292個、綠色通道278個、引種備案玉米品種861個。因此，玉米種子作為我國種業(yè)的主導產(chǎn)品，雜交種質(zhì)量好壞直接影響玉米大田生產(chǎn)、新品種市場規(guī)模及種子企業(yè)的經(jīng)濟效益[5]。

玉米種子的純度是質(zhì)量監(jiān)管的重要指標之一?？焖佟藴实挠衩追N子質(zhì)量檢測方法是保護農(nóng)民利益、維護育種家權(quán)益的重要措施[6]。傳統(tǒng)的玉米種子純度鑒定主要有形態(tài)鑒定、同工酶和貯藏蛋白質(zhì)電泳技術，但由于多態(tài)性有限，隨著玉米品種數(shù)量逐年增多，特別是大量近似品種的存在，難以做出有效鑒定[7]。DNA是生物遺傳信息的直接載體，分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎的標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映[8]。分子標記主要有限制性片段長度多態(tài)性（RFLPs）、隨機擴增多態(tài)性（RAPDs）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLPs）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）和簡單序列重復（SSRs）。簡單序列重復具有技術簡單、結(jié)果可靠、重復性好、共顯性遺傳、可區(qū)分雜合子和純合子等眾多優(yōu)點在玉米種子純度鑒定中有著廣泛的應用[9]。目前，SSRs分析大多用PAGE膠分離銀染檢測，試驗存在耗時、耗力、非自動化，不適用大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)收集和分析等問題。SSR熒光標記技術因具有高效、精確、靈敏、自動化的優(yōu)點，主要應用于玉米品種的遺傳分析，但用于鑒定玉米雜交種純度的文獻報道很少[10-11]，因此，本研究利用SSR熒光標記技術對5個推廣的玉米雜交種進行了純度鑒定研究，研究結(jié)果可為SSR熒光標記快速鑒定玉米雜交種純度提供參考依據(jù)，為逐步完善玉米純度鑒定方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料金穗1203、金艾130、武科8號、方玉36和甘玉801共計5份玉米雜交種，購于甘肅省農(nóng)科院農(nóng)資市場。

1.2 SSR標記引物SSR標記引物參考《玉米品種鑒定DNA指紋方法》（NY/T 1432-2014），以及George 等[12]、Kahler等[13]、王鳳格等[14]、吳金鳳[15]和蘭琴英等[16]報道的文獻，SSR引物的5′端分別用NED、PET、FAM、VIC等進行熒光標記（Applied Biosystems，USA公司合成），20對核心引物信息見表1。

表1 20對引物信息

1.3 試驗方法基因組DNA提取。采取改良的CTAB法提取基因組DNA：取種子發(fā)芽長出的新葉按順序放到2mL 96深孔板中，加2顆3mm鋼珠，將采集好的樣品放到凍干機里進行凍干干燥20～24h后加 600μL CTAB，蓋上硅膠蓋，研磨 3min，取出看是否磨碎，根據(jù)情況可再研磨2～5min；將研磨好的深孔板放到離心機中，4000r/min離心2min；75℃烘箱放置30min，每10min輕輕搖動1次；冷卻后，加600μL氯仿抽提，恒溫振蕩培養(yǎng)箱25℃，搖勻5min；4000r/min離心10min，取300μL上清液移至新的1.2mL 96深孔板；向上清液中加入0.7倍體積的冰異丙醇沉降DNA，加蓋硅膠蓋后放置-20℃條件下 15～30min；4000r/min離心10min，去上清，然后加入200μL 75%的乙醇，4000r/min離心10min，去上清后晾干；加入50μL ddH2O溶解。DNA質(zhì)量和濃度用NanoDrop2000（Thermo Scientific）紫外分光光度計進行測定，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，調(diào)節(jié)工作液濃度。

SSR熒光標記引物篩選。根據(jù)相關文獻[17-18]報道的玉米群體遺傳多樣性研究的取樣技術，采用每份樣品隨機選取15粒種子培養(yǎng)成單株取樣組成一個混合樣本的方法提取DNA作為引物篩選PCR擴增模板。從20對引物中隨機選取10對核心引物。PCR 反應在 Veriti 96 well Thermalcycler（eppendorf）上進行。PCR 反應體系為 10μL，其中，DNA（50ng/μL）2μL，2xMix5.0 μL，Left primer（10μmol/L）0.1μL，Right primer（10μmol/L）0.1μL，ddH2O 2.8μL。PCR反應程序為95℃預變性10min，95℃變性20s，60℃復性30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)后72℃終延伸10min，4℃循環(huán)，復性溫度根據(jù)不同引物進行調(diào)整。反應完后取PCR產(chǎn)物1μL，加入甲酰胺（HIDI）8.9μL，分子量內(nèi)標 LIZ0.1μL混勻后在 PCR 儀上95℃變性 5min，于 4℃保存 10min，2000r/min 離心1min，用 ABI3730XL（Applied Biosystems）DNA 分析儀對PCR產(chǎn)物進行自動熒光檢測。

SSR熒光標記純度鑒定。每份雜交玉米種隨機取96粒種子作為純度鑒定樣品，單獨提取DNA，用篩選的具有多態(tài)性的2對熒光標記核心引物分別進行PCR反應，用ABI3730XL（Applied Biosystems）DNA 分析儀對 PCR 產(chǎn)物進行自動熒光檢測。

數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計。采用Data Collection v3.0軟件整理數(shù)據(jù)，用Gene Marker 2.2.0軟件確定分子量。將毛細管電泳檢測所得的SSR擴增片段信息輸入Microsoft Excel，計算玉米雜交種的純度，公式為P（%）=（NT-ND）/NT×100，其中，P為種子純度，NT為供檢種子數(shù)，ND為雜交種子數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取質(zhì)量分析用NanoDrop2000（Thermo Scientific）紫外分光光度計測定提取的玉米雜交種基因組DNA濃度，并調(diào)節(jié)濃度為50ng/μL，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，檢測結(jié)果見圖1，結(jié)果表明，提取的玉米基因組DNA主帶清晰一致，適合進一步的SSR-PCR分析。

圖1 玉米基因組DNA檢測結(jié)果

2.2 SSR熒光標記引物篩選結(jié)果采用了15個單株混合取樣的方法，隨機選取引物P01、P03、P05、P08、P09、P11、P13、P16、P17、P20 等 10 對 SSR熒光標記引物分別對金穗1203、金艾130、武科8號、方玉36和甘玉801等5份玉米品種進行多態(tài)性引物篩選，篩選結(jié)果見圖2～6。SSR熒光標記引物篩選的3個原則：一是具有雙峰；二是峰值盡量單一、清晰；三是雙峰的峰值差異不大。根據(jù)引物篩選原則，各篩選出了鑒定5份玉米品種純度的2對SSR熒光標記引物，共篩選出了7對引物，分別為bnlg439w1、umc1705w1、umc2007y4、umc1506k12、bnlg2291k4、phi080k15、umc2015k3（表 2）。

圖2 金穗1203玉米品種SSR引物篩選結(jié)果

圖3 金艾130玉米品種SSR引物篩選結(jié)果

圖4 武科8號玉米品種SSR引物篩選結(jié)果

圖5 方玉36玉米品種SSR引物篩選結(jié)果

圖6 甘玉801玉米品種SSR引物篩選結(jié)果

表2 鑒定5份玉米品種純度的引物

2.3 SSR熒光標記純度鑒定結(jié)果每份玉米品種隨機選取96粒種子樣品單獨提取基因組DNA作為PCR擴增模板，根據(jù)篩選出的2對熒光標記引物進行了純度鑒定，若鑒定結(jié)果峰圖是雙峰，且是引物篩選的峰值，則判斷為是雜交種；若結(jié)果是雙峰，但有一個位點是篩選的峰值，另一個位點是其他峰值，則判斷為是異交種；若結(jié)果是雙峰，但2個位點都不是引物篩選時的峰值，則判斷為是雜株；若2個引物在該位點都是單峰，且峰值是引物篩選中的一個峰值，則判斷為是自交種。鑒定部分結(jié)果見圖7，純度值在96.88%～98.44%之間（表3），達到了96%的玉米雜交種純度國家標準。

3 結(jié)論與討論

玉米中SSR多態(tài)性標記極為豐富，利用SSR分子標記技術可檢測玉米染色體上不同位點的簡單重復序列多態(tài)性，能夠有效鑒定雜交種的純度。玉米雜交種純度鑒定需要用特異引物或引物組合來完成自交苗和異型株檢測區(qū)分，因此，引物的篩選就顯得尤為重要。朱盛安等[19]利用50對SSR引物對收集到的18個玉米雜交種及其親本進行SSR標記分析，篩選了一套玉米雜交種純度鑒定的核心SSR引物。劉文彬等[20]分別用 Qiagen和ABI3730兩種DNA分析儀，從111對新型玉米 SSR引物中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、適于自動化分型的9對引物。馮博等[21]確定京科968玉米品種純度鑒定的SSR熒光標記引物組合。本試驗在20對SSR核心引物中分別篩選到了鑒定5個推廣玉米品種的7對純度鑒定引物，使用高分辨率的ABI3730xI DNA分析儀進行了純度鑒定。選用4種熒光標記，根據(jù)峰值來判斷引物相對擴增效率，且通量較高，數(shù)據(jù)分析簡便。能夠有效克服聚丙烯酰胺凝膠電泳帶來的操作較為繁瑣、耗時長、通量低、不適于大量引物的篩選鑒定問題。

圖7 SSR熒光標記鑒定玉米品種純度的部分結(jié)果

表3 玉米品種純度鑒定結(jié)果

SSR熒光標記應用于鑒定玉米品種純度，可以大大縮短種子純度的檢測時間，及時確定不同玉米品種種子質(zhì)量，主要表現(xiàn)在3個方面：一是玉米種業(yè)企業(yè)可以準確快速檢測玉米種子的純度，保證種子的真實性，可以建立起玉米種業(yè)企業(yè)的制種質(zhì)量監(jiān)控體系，有效促進玉米田間制種技術規(guī)程的使用效果，嚴格做好去雜和去雄的工作；二是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種保護辦公室在受理玉米新品種保護時，利用SSR熒光標記幫助做好DUS測試，給申請品種一個身份權(quán)利保護標識，加強玉米新品種保護的效力；三是在每年各級種子管理部門的種子市場執(zhí)法檢查時可以快速對種子純度進行檢測，以此來保護農(nóng)戶的權(quán)益，保障玉米生產(chǎn)安全。

本研究選用甘肅推廣的金穗1203、金艾130、武科8號、方玉36和甘玉801等5個玉米雜交種，采用15個單株混合取樣法提取DNA作為熒光標記引物篩選PCR擴增模板，篩選了7對SSR熒光標記引物并進行了純度鑒定研究，結(jié)果表明，純度值在96.88%～98.44%之間，達到了96%的玉米雜交種純度國家標準。研究結(jié)果為應用ABI3730XL DNA分析儀快速鑒定玉米雜交種純度提供了參考，同時為逐步完善玉米純度鑒定方法奠定了基礎。