蠶絲絲素酪氨酸殘基的偶合修飾與工藝調(diào)控

楊海偉， 王宗乾， 徐晶晶， 王明榮， 王鄧峰

安徽工程大學(xué) 紡織服裝學(xué)院， 安徽 蕪湖 241000)

蠶絲絲素蛋白含有18種α-氨基酸，其中酪氨酸成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)10.84%[1]，且酪氨酸殘基主要分布在絲素蛋白的無(wú)定形區(qū)和結(jié)構(gòu)表面，易受化學(xué)試劑的進(jìn)攻和作用[2-3]，具有較高的反應(yīng)可及度，是絲素蛋白化學(xué)修飾的重要位點(diǎn)。目前，對(duì)絲素蛋白的化學(xué)修飾主要為對(duì)氨基、酚羥基結(jié)構(gòu)的?；揎棧瑢?duì)氨基、羧基結(jié)構(gòu)的烷基化修飾，對(duì)酚羥基的氧化修飾，以及對(duì)殘基中芳香環(huán)的取代反應(yīng)修飾[4-5]。其中，酪氨酸殘基結(jié)構(gòu)中，因酚羥基的電子誘導(dǎo)效應(yīng)，苯環(huán)酚羥基鄰位碳極易發(fā)生芳環(huán)取代反應(yīng)，該芳環(huán)取代修飾是絲素蛋白典型的特征修飾反應(yīng)，極少受到其他反應(yīng)位點(diǎn)的影響[6]。若采用芳胺重氮鹽對(duì)絲素蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾將生成偶氮化合物，該修飾反應(yīng)也被稱為偶合修飾反應(yīng)，且該修飾反應(yīng)主要針對(duì)酪氨酸殘基[7]。酪氨酸殘基的化學(xué)修飾現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的標(biāo)記與定量分析領(lǐng)域，如Cserep G. B.等[8]、Jakubowski等[9]等為標(biāo)記和定量分析蛋白質(zhì)樣品，分別采用Pd(II)、碘分子對(duì)不同蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾，并基于光譜特征實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的標(biāo)記與分析；Pereira Navaza A等[10]通過(guò)IPy2BF4(二吡啶四氟硼化碘)試劑修飾酪氨酸殘基，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)樣品的標(biāo)記，并基于高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)檢測(cè)技術(shù)完成了對(duì)修飾蛋白質(zhì)的定量分析。此外，Neel S. Joshi等基于了三組分曼尼希反應(yīng)、重氮偶合反應(yīng)機(jī)制對(duì)含酪氨酸殘基的小分子蛋白質(zhì)及多肽進(jìn)行了化學(xué)修飾和標(biāo)記[11-12]。Chen W等[13]將酪氨酸殘基的偶合修飾應(yīng)用在蠶絲纖維的染色領(lǐng)域，采用不同結(jié)構(gòu)的芳胺化合物重氮鹽實(shí)現(xiàn)對(duì)蠶絲酪氨酸殘基的偶合修飾染色，修飾后蠶絲具有較高的耐洗和耐摩擦色牢度，豐富了蠶絲纖維的染色技術(shù)；同樣基于酪氨酸殘基偶合修飾反應(yīng)性能，將紫外線吸收結(jié)構(gòu)修飾到了蠶絲的酪氨酸殘基上，提高了蠶絲的耐光穩(wěn)定性能[14]。

綜上所述，絲素蛋白酪氨酸殘基的偶合化學(xué)修飾條件較為溫和，反應(yīng)速率快，重氮組分與絲素蛋白之間形成共價(jià)修飾，具有較高的濕處理牢度，在蛋白的染色與功能化改性方面具有廣闊的應(yīng)用前景。目前較少關(guān)于蠶絲絲素酪氨酸殘基參與偶合修飾的工藝因素與調(diào)控規(guī)律的研究報(bào)道，也缺少關(guān)于該修飾反應(yīng)吸附速率曲線與吸附等溫線的相關(guān)報(bào)道。為此，本文以偶合修飾后蠶絲絲素的顏色深度K/S值為衡量指標(biāo)，分析了堿預(yù)處理、重氮鹽組分的用量、時(shí)間、pH值、浴比等工藝參數(shù)對(duì)鄰硝基苯胺重氮鹽修飾酪氨酸殘基的影響規(guī)律，同時(shí)研究了重氮鹽對(duì)酪氨酸殘基偶合修飾的吸附速率曲線、吸附等溫線類型等內(nèi)容，以期為絲素蛋白的化學(xué)修飾及其性能調(diào)控提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與化學(xué)藥劑

蠶絲織物(78 g/m2，淄博大染坊絲綢公司提供)。實(shí)驗(yàn)前，該蠶絲織物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Na2CO3溶液煮沸脫膠2次，每次各30 min，脫膠浴比為1∶50，脫膠后蠶絲視為蠶絲絲素纖維。

藥品：鄰硝基苯胺、亞硝酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、36%濃鹽酸、尿素、氫氧化鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉(上海阿拉丁試劑有限公司)，均為分析純。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

Rapid L-12 A-1型水浴恒溫振蕩器(廈門(mén)瑞比精密機(jī)械有限公司)；HJ-5型多功能攪拌器(金壇市杰瑞爾有限公司)；UV2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美公司)；Datacolor650型測(cè)色配色儀(美國(guó)Datacolor公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90型粒度及電位分析儀(英國(guó)馬爾文公司)。

1.3 蠶絲絲素纖維織物的堿預(yù)處理

為對(duì)比測(cè)試堿預(yù)處理對(duì)蠶絲絲素蛋白偶合修飾的影響，偶合修飾實(shí)驗(yàn)前1 h內(nèi)，采用浸軋工藝對(duì)蠶絲絲素纖維進(jìn)行堿預(yù)處理。具體工藝為：室溫下織物先經(jīng)10 g/L的Na2CO3溶液浸漬30 min，浴比為1∶100，之后進(jìn)行浸軋，控制織物帶液率為100%。

1.4 蠶絲絲素的偶合修飾

參照文獻(xiàn)[15]制備鄰硝基苯胺重氮鹽，并配制不同pH值的緩沖溶液；然后在相同工藝條件下，分別對(duì)堿預(yù)處理與未處理的蠶絲絲素纖維進(jìn)行偶合修飾，分析了堿預(yù)處理、重氮鹽組分用量、pH值、時(shí)間等工藝參數(shù)對(duì)偶合修飾蠶絲絲素纖維K/S值的影響規(guī)律。

1.5 鄰硝基苯胺重氮鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為測(cè)試蠶絲絲素蛋白偶合修飾的吸附速率曲線與吸附等溫線，首先建立了鄰硝基苯胺重氮鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式為Y=7.331 33X+0.008 93，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.993 66，鄰硝基苯胺重氯鹽濃度范圍為0.03～0.18 mmol/L。式中：Y為波長(zhǎng)278 nm下的光度值；X為鄰硝基苯胺重氮鹽的濃度，mmol/L。

1.6 測(cè)試方法

1.6.1修飾蠶絲絲素纖維的K/S值測(cè)試

采用測(cè)色配色儀測(cè)試修飾蠶絲絲素纖維的K/S值。測(cè)試條件：待測(cè)樣品2次對(duì)折，D65光源，2°角，采樣孔徑為5 mm，波段為350～700 nm，每塊樣品取5點(diǎn)處測(cè)試，取其平均值。

1.6.2蠶絲絲素纖維Zeta電位值測(cè)試

采用機(jī)械方法將蠶絲絲素纖維磨成粉末，然后分別稱取一定質(zhì)量的纖維粉末，浸漬于不同pH值的水溶液中，磁力攪拌10 min，采用粒度及電位分析儀測(cè)試不同粉末樣品的Zeta電位值。

1.6.3偶合修飾的吸附過(guò)程測(cè)定

采用殘液吸光度法，測(cè)試不同反應(yīng)時(shí)間后偶合修飾體系中鄰硝基苯胺重氮鹽在278 nm條件下的吸光度值，依據(jù)鄰硝基苯胺重氮鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線求不同時(shí)刻的濃度，并按照下式計(jì)算不同時(shí)刻鄰硝基苯胺重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附量，繪制偶合修飾的吸附量-時(shí)間曲線[16]。

式中：Qt為t時(shí)刻鄰硝基苯胺重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附量，mmol/g；c0為鄰硝基苯重氮鹽的初始濃度，mmol/L；ct為t時(shí)刻鄰硝基苯重氮鹽的濃度，mmol/L；V為反應(yīng)溶液的體積,L；m為蠶絲絲素纖維的質(zhì)量,g。

1.6.4吸附等溫線的繪制

配制不同濃度的重氮鹽反應(yīng)液，然后將質(zhì)量為1.00 g的蠶絲絲素纖維分別投入到上述各反應(yīng)液中，控制偶合反應(yīng)液pH值為6.8，反應(yīng)浴比為1∶500，于5 ℃條件下進(jìn)行偶合反應(yīng)，待吸附平衡后，測(cè)定殘液的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算平衡時(shí)殘液中的重氮鹽組分質(zhì)量濃度Ds，按下式計(jì)算平衡時(shí)各纖維上的重氮鹽組分吸附量Df[17]。以Df對(duì)Ds作圖繪制吸附等溫線。

式中：C0為反應(yīng)液的起始質(zhì)量濃度，mg/L；Ceq為吸附平衡時(shí)反應(yīng)液的質(zhì)量濃度mg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾蠶絲絲素K/S值的影響因素

2.1.1堿預(yù)處理對(duì)K/S值的影響

測(cè)試了堿預(yù)處理和未處理的蠶絲絲素纖維在偶合修飾后的K/S值，結(jié)果如圖2所示。

圖2 蠶絲絲素纖維的K/S值曲線Fig.2 K/S value curves of silk fibroin fiber

由圖可知，堿預(yù)處理工藝對(duì)蠶絲絲素纖維偶合修飾有較大的影響，在相同的偶合修飾工藝下，堿預(yù)處理蠶絲絲素纖維呈黃色，在350～500 nm波段具有較高的K/S值，且得色較深。修飾后蠶絲絲素蛋白分子與鄰硝基苯胺重氮鹽分子結(jié)構(gòu)形成大共軛結(jié)構(gòu)[13]，在可見(jiàn)光區(qū)產(chǎn)生特征吸收，吸收強(qiáng)度與參與反應(yīng)的酪氨酸殘基數(shù)量成正比，即蠶絲絲素蛋白中越多的酪氨酸殘基參與修飾反應(yīng)，則修飾后蠶絲絲素纖維得色越深，說(shuō)明蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基偶合修飾反應(yīng)率越高。

綜上，蠶絲絲素纖維經(jīng)堿預(yù)處理后，酪氨酸殘基參與偶合修飾的反應(yīng)率增加。堿預(yù)處理后，蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基結(jié)構(gòu)的酚羥基會(huì)發(fā)生電離形成苯氧基負(fù)離子，使其電子云密度增加，從而促進(jìn)了偶合修飾反應(yīng)的發(fā)生[4]，推測(cè)堿預(yù)處理對(duì)蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基電子云密度與偶合修飾反應(yīng)的影響機(jī)制如圖3所示。

注：代表蠶絲絲素蛋白大分子。

為對(duì)比堿預(yù)處理后蠶絲絲素纖維Zeta電位值的變化，同時(shí)測(cè)試了不同酸堿環(huán)境下蠶絲絲素纖維的Zeta電位值，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同pH值條件下蠶絲絲素纖維Zeta電位值Fig.4 Zeta potential values of silk fibroin fiber at different pH values

由圖可知：蠶絲絲素纖維在強(qiáng)酸環(huán)境下帶正電荷，此時(shí)絲素蛋白發(fā)生堿式電離，且纖維的Zeta電位值隨pH值的升高而逐漸減??；蠶絲絲素纖維的等電點(diǎn)處于pH值為4～4.1之間，等電點(diǎn)后，再隨pH值的升高，蠶絲絲素蛋白發(fā)生了酸式電離，且隨pH值的升高，絲素纖維的Zeta電位值的絕對(duì)值逐漸升高，表明纖維表面的負(fù)電荷效應(yīng)更加顯著：因此，經(jīng)堿預(yù)處理后，蠶絲絲素纖維表面帶有較多負(fù)電荷，而未經(jīng)堿預(yù)處理的蠶絲絲素纖維在偶合體系(pH值為6.8)下，纖維表面的負(fù)電荷量相對(duì)較少，且絲素蛋白或處于尚未電離狀態(tài)，負(fù)電荷效應(yīng)較低，對(duì)比之下，堿預(yù)處理后的蠶絲絲素纖維與重氮鹽正離子之間發(fā)生偶合修飾反應(yīng)的速率和效率將更高。

綜上所述，蠶絲絲素纖維的堿預(yù)處理一方面增加了酪氨酸殘基結(jié)構(gòu)中酚羥基鄰位碳的電子云密度，另一方面降低蠶絲絲素纖維的Zeta電位值，促使纖維帶有更多的負(fù)電荷，二者將有利于絲素蛋白酪氨酸殘基與重氮鹽發(fā)生偶合修飾反應(yīng)。

2.1.2重氮鹽組分用量對(duì)K/S值的影響

依據(jù)鄰硝基苯胺重氮鹽與蠶絲絲素蛋白中酪氨酸成分的量比值，設(shè)定了8個(gè)反應(yīng)梯度：1/6、1/4、1/2、2/3、1、1.5、2.3，并在5 ℃條件下反應(yīng)30 min，浴比為1∶100，pH值為6。測(cè)試了在不同重氮鹽組分用量條件下偶合蠶絲絲素纖維的K/S值，結(jié)果如圖5所示。

圖5 重氮鹽用量對(duì)蠶絲絲素纖維K/S值的影響Fig.5 Effect of dosage of diazonium salt on K/S value of silk fibroin fiber

由圖5可知，隨著重氮組分用量的增加，修飾后蠶絲絲素纖維的K/S值逐漸升高，當(dāng)n(重氮鹽)∶n(酪氨酸)=2∶3時(shí)，修飾纖維的K/S值趨于穩(wěn)定，再持續(xù)增加重氮組分用量，K/S值幾乎沒(méi)有提高，表明該用量下，蠶絲絲素蛋白中酪氨酸殘基的偶合修飾反應(yīng)已達(dá)到平衡。當(dāng)n(重氮鹽)∶n(酪氨酸)=2∶3時(shí)，絲素蛋白中酪氨酸殘基參與的偶合修飾反應(yīng)已達(dá)到平衡，原因與絲素蛋白的結(jié)構(gòu)直接相關(guān)，絲素蛋白由結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)組成，酪氨酸成分在蛋白結(jié)晶區(qū)也有分布[6]，但僅絲素蛋白無(wú)定形區(qū)中的酪氨酸殘基才有可能參與到與重氮鹽的偶合修飾反應(yīng)中，且酪氨酸殘基參與修飾反應(yīng)還可能與蛋白微結(jié)構(gòu)及反應(yīng)位阻有關(guān)[6]，具體影響仍有待進(jìn)一步研究證明。

因酪氨酸殘基與重氮鹽之間的偶合修飾生成的是共價(jià)鍵連接，二者反應(yīng)與物質(zhì)的量比相關(guān)，在n(重氮鹽)∶n(酪氨酸)=2∶3的基礎(chǔ)上，再繼續(xù)增加重氮鹽用量已無(wú)必要，同時(shí)增加重氮鹽用量不利于調(diào)節(jié)反應(yīng)浴的pH值；重氮鹽組分過(guò)量也將加重后續(xù)污水的處理難度。

2.1.3偶合反應(yīng)的pH值對(duì)K/S值的影響

偶合修飾pH值對(duì)修飾蠶絲絲素纖維K/S值的影響規(guī)律如圖6所示。

圖6 偶合pH值對(duì)蠶絲絲素纖維K/S值的影響Fig.6 Effect of pH values of coupling reaction on K/S value of silk fibroin fiber

由圖6可知：當(dāng)偶合反應(yīng)的pH值在蠶絲絲素纖維等電點(diǎn)以下時(shí)其K/S值較低；當(dāng)pH值在3～6.8之間時(shí)，隨著偶合pH值升高，蠶絲絲素纖維的K/S值也隨之增大。這是因?yàn)猷徬趸桨分氐}在強(qiáng)酸性條件下，反應(yīng)活性較低，隨著pH值升高，其反應(yīng)活性逐漸提升，因此重氮鹽與蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基發(fā)生偶合修飾反應(yīng)的活性增強(qiáng)，同時(shí)有利于促進(jìn)更多的酪氨酸殘基參與偶合修飾反應(yīng)，但是當(dāng)pH值超過(guò)6.8，繼續(xù)增大偶合反應(yīng)的pH值時(shí)，蠶絲絲素纖維的K/S值不再增大反而降低，這是因?yàn)猷徬趸桨分氐}在較高的pH值條件下，重氮鹽結(jié)構(gòu)將由順式逐漸向失去反應(yīng)活性的反式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[18]，削弱了重氮鹽的偶合反應(yīng)能力，造成偶合修飾蠶絲絲素纖維的K/S值降低。因此，本文實(shí)驗(yàn)選取偶合pH值為6.8為蠶絲絲素纖維獲取最大K/S值的條件。

2.1.4修飾時(shí)間對(duì)K/S值的影響

偶合修飾反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾蠶絲絲素纖維K/S值的影響規(guī)律如圖7所示。

圖7 偶合時(shí)間對(duì)蠶絲絲素纖維K/S值的影響Fig.7 Effect of coupling time on K/S value of silk fibroin fiber

由圖可知：當(dāng)偶合反應(yīng)時(shí)間不超過(guò)45 min時(shí)，隨著偶合反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蠶絲絲素纖維的K/S值逐漸升高，但增加速率較為緩慢；當(dāng)偶合時(shí)間達(dá)到45 min時(shí)，蠶絲絲素纖維的K/S值最大，為20.47；隨后再延長(zhǎng)偶合時(shí)間，蠶絲絲素纖維的K/S值將不再增加反而降低。為確?？煞磻?yīng)的酪氨酸殘基全部參與修飾反應(yīng)，本文實(shí)驗(yàn)選取偶合時(shí)間45 min為蠶絲絲素纖維獲取最大K/S值的條件。

2.1.5其他工藝因素對(duì)K/S值的影響

偶合修飾自身是溫和的反應(yīng)體系，前期研究已證明提高偶合修飾溫度將導(dǎo)致重氮鹽分解變質(zhì)，使其反應(yīng)活性降低[19]，同時(shí)文獻(xiàn)[4,6]表明低溫下偶合反應(yīng)可進(jìn)一步提升修飾位點(diǎn)的專一性，減少酪氨酸殘基偶合修飾反應(yīng)中副反應(yīng)的發(fā)生。為此，可認(rèn)為進(jìn)一步探討提高偶合溫度對(duì)蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基偶合修飾的影響已經(jīng)沒(méi)有意義，因此，本文蠶絲絲素纖維的偶合修飾在5 ℃條件下進(jìn)行。

2.2 酪氨酸殘基偶合修飾的吸附過(guò)程

依據(jù)1.6.3節(jié)方法，測(cè)試了鄰硝基苯胺重氮鹽在蠶絲絲素纖維上吸附量-時(shí)間曲線，結(jié)果如圖8所示。

圖8 鄰硝基苯胺重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附過(guò)程Fig.8 Adsorption process of o-nitroaniline diazonium salt on silk fibroin fiber

由圖可知，重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附時(shí)間短，吸附效率高，說(shuō)明重氮鹽與蠶絲絲素纖維反應(yīng)用時(shí)短，反應(yīng)速率高；特別在該修飾反應(yīng)的初期，吸附速率曲線具有較高的斜率。蠶絲絲素纖維的偶合修飾反應(yīng)具有的高效率是由該修飾反應(yīng)機(jī)制決定的，在偶合修飾條件下，堿預(yù)處理可促進(jìn)絲素蛋白的酸式電離，纖維帶有負(fù)電荷，纖維與重氮鹽組分產(chǎn)生庫(kù)倫引力，重氮組分與蠶絲絲素纖維具有較強(qiáng)的親和力，蠶絲絲素纖維可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)重氮鹽組分產(chǎn)生強(qiáng)烈吸附，此時(shí)不存在傳統(tǒng)陰離子染料對(duì)蠶絲纖維染色過(guò)程中出現(xiàn)的雙電子層阻礙纖維對(duì)染料離子吸附的問(wèn)題；吸附到蠶絲絲素纖維表面的重氮組分可與酪氨酸殘基中酚羥基的鄰位發(fā)生親電取代反應(yīng)，堿預(yù)處理將使酚羥基發(fā)生電離形成苯氧基負(fù)離子，進(jìn)一步增加酚羥基鄰位富電子不飽和碳的電子云密度，使偶合修飾反應(yīng)進(jìn)一步加速。

由圖8還可看出：在修飾反應(yīng)初始階段，重氮鹽組分在蠶絲絲素纖維上強(qiáng)烈吸附并快速發(fā)生偶合反應(yīng)；修飾反應(yīng)20 min后，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附量增加緩慢，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到45 min時(shí)，反應(yīng)接近平衡，吸附量增加不再明顯。

2.3 酪氨酸殘基偶合修飾的吸附等溫線

依據(jù)1.6.4節(jié)方法，在0.03～0.18 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，采用6個(gè)不同起始濃度的鄰硝基苯胺重氮鹽分別對(duì)蠶絲素纖維進(jìn)行偶合修飾，測(cè)試了鄰硝基苯胺重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附等溫線，結(jié)果如圖9所示。采用Origin9.0作圖軟件按照Langmuir型、Freundlich型2種吸附類型的公式進(jìn)行擬合，擬合公式[20 ]分別為y=Qbx/(1+bx)，y=Qxb。其中：Q為重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附飽和值；b為吸附平衡常數(shù)，與吸附位點(diǎn)的親和力有關(guān)。

注：和分別為L(zhǎng)angmuir型、Freundlich型2種擬合曲線的相關(guān)系數(shù)。

3 結(jié) 論

1) 堿預(yù)處理是影響蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基與鄰硝基苯胺重氮鹽發(fā)生偶合修飾反應(yīng)的重要因素；堿預(yù)處理可促使酪氨酸殘基中酚羥基電離，增加酚羥基鄰位碳的電子云密度，同時(shí)堿預(yù)處理降低了絲素蛋白的Zeta電位值，二者作用均有助于絲素蛋白對(duì)鄰硝基苯胺重氮鹽的吸附并與其發(fā)生偶合修飾反應(yīng)。

2) 經(jīng)單因素優(yōu)化，經(jīng)鄰硝基苯胺重氮鹽偶合修飾的蠶絲絲素纖維在n(重氮鹽)∶n(酪氨酸)=2∶3，pH值為6.8，溫度為5 ℃條件下反應(yīng)45 min可獲得較高的K/S值；

3) 絲素蛋白酪氨酸殘基與鄰硝基苯胺重氮鹽的偶合修飾反應(yīng)具有較高的反應(yīng)速率，該修飾反應(yīng)耗時(shí)短；分別采用Langmuir與Freundlich 模型反應(yīng)的吸附等溫線進(jìn)行擬合對(duì)比，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白的偶合修飾反應(yīng)更符合Langmuir 模型。