手性2，2'-聯(lián)吡啶衍生物的不對稱合成

蘇 適，韓美欣，高婷婷，李慧宇，潘芷茹

腫瘤血管是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的病理基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮生長因子是腫瘤血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，它與腫瘤血管的生成有非常密切聯(lián)系.缺少新生血管的人體腫瘤會一般被限制在很小的范圍內(nèi)無法生長擴散，因此，抑制和阻斷血管內(nèi)皮生長因子在腫瘤組織中的表達可達到抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的目的[1,2].研究結(jié)果顯示，分子中含有氮芳雜環(huán)、酰胺結(jié)構(gòu)以及亞胺結(jié)構(gòu)的血管內(nèi)皮生長因子小分子抑制劑，在體外細(xì)胞和動物的實驗中對腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的抑制作用.

本文對此類化合物構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，分子中的芳環(huán)或取代芳環(huán)可作為疏水性基團，分子中氮芳雜環(huán)中的氮原子、酰胺鍵可與血管內(nèi)皮生長因子產(chǎn)生氫鍵作用[3].因此，設(shè)計合成具有多個結(jié)合位點，生物活性高的血管內(nèi)皮生長因子小分子抑制劑已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的熱點.基于對血管內(nèi)皮生長因子抑制劑構(gòu)效關(guān)系分析，設(shè)計了以吡啶衍生物為起始原料，通過縮合反應(yīng)引入不同保護基和不同構(gòu)型的光學(xué)純的α-氨基酸作為手性源來調(diào)控分子的立體化學(xué)特性，對手性聯(lián)吡啶衍生物合成路線進行設(shè)計如Scheme1，對所合成的化合物進行抗腫瘤活性進行檢測.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

核 磁 共 振 儀 （BRUKE-400）； 旋 光 儀（PerkinElmerModel341LC）； 高 分 辨 質(zhì) 譜 儀（JMS-800D）；無水四氫呋喃、乙醚使用鈉絲除水后重蒸，無水苯、甲苯、二氯甲烷使用鈉絲除水，丙酮采用分子篩除水.

2-溴-3-(1,3-乙二醇縮醛-2-烷基)吡啶3[4]按文獻方法合成，(三丁基錫)-3-(1，3-乙二醇縮醛-2-烷基)吡啶(4)[5]按文獻方法改進進行合成，其余試劑均為分析純，其中無水四氫呋喃、乙醚使用鈉絲除水后重蒸，無水苯、甲苯、二氯甲烷使用鈉絲除水.

1.2 化合物的合成

(三丁基錫)-3-(1，3-乙二醇縮醛-2-烷基)吡啶 （4） 的 合 成.氮 氣 保 護 下 ， 將（3）（1.56g，0.68mmol，1.0 equiv）溶于 3.0mL 無水乙醚，在-70℃下逐滴加入正丁基鋰（0.96 mL，1.6 M），在-70℃下攪拌30 min.用雙針頭管將溶于1mL無水乙醚的正三丁基氯化錫0.66mg（2.04mmol）轉(zhuǎn)移至反應(yīng)液中，在-70℃下攪拌0.5h.TLC檢測反應(yīng)結(jié)束后，加入水淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，飽和碳酸氫鈉水洗，無水硫酸鈉干燥有機相，減壓蒸除溶劑，柱層析分離純化（V（乙酸乙酯）：V（石油醚）=1：40）蒸發(fā)溶劑得4，無色油狀物，收率90%；1H NMR δ：8.71 （dd，J=4.8Hz，2.0Hz，1H），7.73 （dd，J=8.0Hz，1.4Hz，1H），7.10-7.20 （m，1H），5.77（s，1H），3.90-4.20 （m，4H），1.50-1.70（m，6H），1.25-1.40（m，6H），1.15-1.25（m，6H），0.80-0.95（m，9H）

2-[3-(1，3-乙二醇縮醛-2-烷基)吡啶]-3-硝基吡啶（5）的合成.在氮氣的保護下，將（2）105mg（0.238mmol）和（4）72.1mg（0.357mmol），溶于 7mL無水四氫呋喃中，加入27.5mg（0.024mmol）三苯基磷鈀，2.7mg（0.019mmol）溴化亞銅，加熱回流 4.5h.TLC檢測反應(yīng)結(jié)束后，冷卻反應(yīng)液，減壓蒸除去溶劑，柱層析分離純化（（乙酸乙酯）：V（石油醚）=1：40）蒸發(fā)溶劑得5，黃色油狀物，收率85%；1H NMR δ：8.88(dd，J=4.6Hz，1.4Hz，1H），8.62(dd，J=4.8Hz，1.6Hz，1H），.40(dd，J=8.2Hz，1.4Hz，1H），8.06(dd，J=7.8Hz，1.4Hz，1H），7.55 （dd，J=8.4Hz，4.8Hz，1H），7.42 （dd，J=8.0Hz，4.8Hz，1H），6.10（s，1H），3.80-3.95 （m，4H）；13C NMR δ：（154.0，153.1，152.0，149.4，145.8，135.6，132.6，132.4，132.1，132.0，131.9，128.6，128.5，123.6，123.5，100.5，65.1（2C）；HRMS （ESI）calcd for C13H12N3O4[M+H]+：274.0822，found 274.0828（-1.9ppm，-0.6mmu）

2-[3-(1，3-乙二醇縮醛-2-烷基)吡啶]吡啶-3- 胺（6）的合成.將（5）52.9mg（0.194mmol）溶于8mL 乙醇，加入 PtO2·3H2O 5.45mg（0.019mmol），1 atm的氫氣壓力下催化氫化，反應(yīng)進行4.0h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束.經(jīng)過硅藻土過濾懸浮物，減壓蒸除溶劑，柱層析分離純化（V（乙酸乙酯）：V（石油醚）=1：40）蒸發(fā)溶劑得（6），黃色半固體，收率 94%；1H NMR δ：（8.60(dd，J=4.8Hz，2.0Hz，1H），8.13（dd，J=8.0Hz，2.0Hz，1H），8.07-8.10 （m，1H），7.60-7.70（m，1H），7.40-7.50 （m，1H），7.34（dd，J=8.0Hz，4.8 Hz，1H），4.60-4.80 （br，NH2），4.05-4.15（m，2H），3.90-4.00 （m，2H）；13C NMR δ：（156.5，148.5，142.4，141.2，138.6，133.6，132.1，132.0，131.9，128.6，128.5，124.0，123.8，122.9，100.3，65.5；HRMS（ESI）calcd for C13H14N3O2[M+H]+：244.1081，found 244.1089（-3.7ppm，-0.8mmu）

化合物將 8（S）和 8（R）的合成通法.將（6）97.6 mg（0.4mmol）和（7）（60mmol）溶于 10mL 二氯甲烷中，加入 EDCI 191.7mg（0.6mmol），室溫下攪拌，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束后，水洗（3×10ml），無水硫酸鈉干燥有機相，過濾，減壓蒸除溶劑，柱層析法分離純化，得純品.

8（S）：無色蠟狀固體，產(chǎn)率 83%,[α]D23=-47.1（c=2.8，CHCl3）；1H NMR（CDCl3）（12.1-12.8(br，1H），8.96（d，J=6.8Hz，1H），8.50-8.80（m，1H），8.34（d，J=3.6Hz，1H），7.97（d，J=7.6 Hz，1H），7.00-7.50（m，7H），5.10（s，1H），4.57（s，1H），4.40（s，2H），3.80（s，2H），2.90-3.50 （m，2H），2.22 （t，J=5.4Hz，OH），1.25-1.60（m，9H）；13C NMR（CDCl3）（170.9，168.9，155.1，148.0，143.0，140.9，137.4，136.3，134.7，130.2，129.3，129.1，128.6，126.9，124.6，122.4，80.3，69.8，67.2，60.7，57.1，55.0，38.7，30.8，29.7，29.4，28.3；HRMS （ESI）calculated forC28H31N4O6[M+H]+：507.2238，found 507.2245（-1.4 ppm，-0.7mmu）

8（R）：白色固體，產(chǎn)率 47%，[α]D23=+42.2（c=2.7，CHCl3）；1H NMR （CDCl3）：（11.2-11.9(br，1H），8.82（d，J=7.6Hz，1H），8.52（s，1H），8.45（d，J=3.6Hz，1H），8.19（dd，J=8.0Hz，1.6Hz，1H），7.00-7.50（m，7 H），6.42（s，1H），5.00（s，H），4.50（s，1H），3.90-4.20（m，4H），2.90-3.30（m，2H），1.40（s，9H）；13C NMR（CDCl3）：（170.3，155.2，147.5，144.2，143.6，137.4，136.3，134.7，133.9，129.3，129.1，128.5，127.0，123.7，123.2，100.2，80.2，65.5，60.4，56.7，38.6，29.7，28.3；HRMS （ESI）calculated for C27H30N4O5[M+H]+：491.2289，found 491.2298（-1.9 ppm，-0.9 mmu）

化合物將 9（S）和 9（R）的合成通法.將化合物（8）（50.0mg，0.1mmol，1.0equiv） 溶 于 THF-H2O（10mL，4:1v/v）Yb （OTf）3（76.15mg，0.12mol，1.1equiv）室溫下攪拌，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束后，二氯甲烷萃取反應(yīng)液（3×10ml），無水硫酸鈉干燥有機相，過濾，減壓蒸除溶劑，快速柱層析法分離純化，得純品.

9（S）：無色蠟狀固體，產(chǎn)率 70%.[α]D23=-40.3（c=3.0，CHCl3）；1H NMR （CDCl3）：（12.3-12.8（br，1H），8.98（d，J=7.6Hz，1H），8.77（s，1H），8.34（dd，J=4.8Hz，1.2Hz，1H），8.02 （d，J=7.2Hz，1H），7.30-7.60 （m，2H），4.60-5.10 （m，1H），4.10-4.60（m，3H），2.78（d，J=13.6Hz，2H），2.20（s，OH），0.90-1.99（m，18H）：13C NMR （CDCl3）：（172.3，168.9，155.5，148.2，142.9，140.8，137.7，135.1，132.1，132.0，130.3，129.2，128.6，128.4，124.7，122.5，80.2，69.8，67.2，64.3，63.7，60.6，55.0，54.5，42.0，29.6，29.4，28.3，25.3，24.9，23.0，21.8，HRMS （ESI） calculated for C24H33N4O6[M+H]+：473.2395，found 473.2407（-2.7 ppm，-1.2 mmu）

9（R）：無色蠟狀固體產(chǎn)率47%，[α]D23=+45.9（c=2.6，CHCl3）；1H；NMR （CDCl3）：（12.1-12.8br，1H）8.91（d，J=7.2Hz，1H），8.53（s，1H），8.30（d，J=3.2Hz，1H），7.93 （d，J=7.6Hz，1H），6.90-7.45（m，7H），5.09 （d，J=6.4Hz，1H），4.54（d，J=5.6Hz，1H），4.36（s，2H），3.76（s，2H）.2.91-3.40（m，2H），2.10-2.20（br，OH）；13C NMR （CDCl3）（171.1， 170.9，168.9，155.1，148.1，143.0，140.9，137.4，136.3，134.7，130.2，129.3，129.1，128.6，126.9，124.7，122.4，80.3，67.2，60.7，60.4，57.1，38.8，29.7，29.3，28.3；HRMS（ESI）calculated for C27H31N4O6[M+H]+：507.2238，found 507.2244（-1.2 ppm，-0.1 mmu）

1.3 體外抗腫瘤活性測試

活性測試方法：將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上，根據(jù)靶細(xì)胞不同選擇每孔104～106個不同的細(xì)胞數(shù).加入待測的化學(xué)藥物，同時設(shè)相應(yīng)的對照，置于37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間隨測定內(nèi)容及靶細(xì)胞不同而異.培養(yǎng)終止前4h加入5mg/mL的MTT溶液10～25ul/孔.終止培養(yǎng)，將所形成的結(jié)晶物用有機溶劑完全溶解后，在分光光度計上測定其再波長490nm或570nm處得A值（不同溶劑使用測定波長不同）.統(tǒng)計獲得的實驗數(shù)據(jù)，通過IC50計算軟件，輸入多組試驗數(shù)據(jù)，軟件自動擬合生成曲線圖活性因子的單位、效應(yīng)細(xì)胞殺傷率等.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成

化合物8的合成過程中，在還原產(chǎn)物6中引入不同光學(xué)純的α-氨基酸作為手性源，在目標(biāo)分子中引入手性中心，以此調(diào)控聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu)手性軸的立體化學(xué)特征.反應(yīng)中偶聯(lián)劑DCC難以完全除盡，采用1H NMR進行結(jié)構(gòu)鑒定時，在1H NMR譜的高場有雜質(zhì)峰存在，影響化合物結(jié)構(gòu)鑒定.相反，選用易于水洗除去的EDCI作為偶聯(lián)劑，能夠有效克服上述缺點.

2.2 體外抗腫瘤活性

選擇五種不同的腫瘤細(xì)胞株（HCT-8：人結(jié)腸癌細(xì)胞；Bel7402：人肝癌細(xì)胞；BGC-823：人胃癌細(xì)胞；A549：人肺腺癌細(xì)胞；A2780：人卵巢癌細(xì)胞）對目標(biāo)化合物8和9的抗腫瘤活性進行了生物評價，見表1.

表1 目標(biāo)化合物抗腫瘤活性篩選

評價數(shù)據(jù)結(jié)果表明，目標(biāo)分子對所選用的五種腫瘤細(xì)胞株的增殖沒有明顯的抑制活性.隨后，為了改變化合物的酯水分配系數(shù)，提高其跨膜能力，增強化合物與血管內(nèi)皮生長因子的作用能力，對化合物8和9進行了化學(xué)修飾和結(jié)構(gòu)改造.期待通過對化合物8和9結(jié)構(gòu)的改造來調(diào)整化合物的酯水分配系數(shù)，提高分子的跨膜能力，有利于分子進入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部與血管內(nèi)皮生長因子發(fā)生相互作用，提高化合物的抗腫瘤增殖的能力，期望發(fā)現(xiàn)與血管內(nèi)皮生長因子具有高親和力的新型先導(dǎo)化合物.

3 結(jié)論

本文設(shè)計并合成了一系列新型的含有手性中心的聯(lián)吡啶類化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR和HRMS譜圖確證，實驗結(jié)果該方法對合成具有潛在生物活性的手性聯(lián)吡啶化合物的有一定借鑒價值.MTT實驗結(jié)果顯示，目標(biāo)化合物對HCT-8、Bel7402、BGC-823、A549、A2780 細(xì)胞無顯著抑制活性.