納米硅以及納米三氧化二鐵對(duì)大鼠中樞神經(jīng)行為的影響

潘洋 張?chǎng)卧?/p>

納米二氧化硅（nano-Si）及納米氧化鋅（nano-Fe2O3）被人們大量使用，其主要應(yīng)用在紡織工業(yè)、塑料制造以及涂料等領(lǐng)域，因此，納米顆粒物與人接觸的概率較大。在關(guān)于納米顆粒物的相關(guān)研究中，納米顆粒物可以由皮膚、呼吸道、藥物及腸胃等方式進(jìn)入體內(nèi)，隨后通過(guò)參與血液和淋巴系統(tǒng)的循環(huán)逐步影響到身體各個(gè)器官。國(guó)內(nèi)外大量有關(guān)納米材料在毒性方面的研究表明，納米材料可通過(guò)多種方式作用于血腦屏障，如血液循環(huán)，破壞了血腦屏障的功能，造成血腦屏障紊亂，使納米顆粒物入侵大腦，在一定程度上影響了中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使神經(jīng)行為產(chǎn)生變化[1-10]。本研究通過(guò)灌胃對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，分別觀察納米二氧化硅和納米氧化鋅作用于大鼠時(shí)，是否會(huì)對(duì)神經(jīng)行為造成改變，并進(jìn)行討論，從而證明大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)被這兩種納米顆粒物造成一定的損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康成年Wistar大鼠40只，體重160～180 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-（軍） 2002-001。動(dòng)物隨機(jī)分為5組：對(duì)照組（C組）、nano-Si高劑量組（SH組）、nano-Si低劑量組（SL組）、nano-Fe2O3高劑量組（FH組）、nano-Fe2O3低劑量組（FL組），每組8只。nano-Si購(gòu)于上海潤(rùn)河納米研究科技有限公司，nano-Fe2O3由國(guó)家納米中心提供，兩種納米顆粒物粒物直徑大小為20～40 nm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 采用灌胃的方式進(jìn)行藥物干預(yù)，實(shí)驗(yàn)組給予生理鹽水懸濁液及納米顆粒物，對(duì)照組給予生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)前進(jìn)行5 min的懸濁液震蕩，避免納米顆粒物的沉積。灌胃藥物的劑量分別為低劑量組給予（25 mg/kg），高劑量組給予（100 mg/kg）。進(jìn)行28 d的藥預(yù)，每周測(cè)量大鼠的體重變化。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) （1）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：該裝置是由黑色膠板制作的長(zhǎng)方體敞箱，高50 cm，底面為邊長(zhǎng)100 cm的正方形，劃分為25個(gè)等邊方格。于上午8：00-10：00在安靜房間內(nèi)進(jìn)行此試驗(yàn)。大鼠在中心方格內(nèi)進(jìn)行3 min分實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠3 min內(nèi)后肢直立次數(shù)、大便粒數(shù)、穿越的格數(shù)、修飾次數(shù)。在每次實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)束后，對(duì)箱子內(nèi)部進(jìn)行清理，從而保障下次實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，避免下一只大鼠在測(cè)試中受到干擾，干預(yù)前及干預(yù)結(jié)束后分別測(cè)量一次。（2）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：裝置為內(nèi)分4個(gè)象限的正圓小水池，直徑150 cm，池中任選一個(gè)象限，在其中央放置一面積10 cm×10 cm 的正方形透明站臺(tái)，隱蔽于水面下1～2 cm，水溫（20±2）℃。實(shí)驗(yàn)中水迷宮附近參照物（包括實(shí)驗(yàn)人員觀察時(shí)所占的方位）保持不變。定位航行試驗(yàn)：連續(xù)4 d，訓(xùn)練3次/d。將大鼠面對(duì)池壁，使其依次從其他三個(gè)非平臺(tái)象限進(jìn)入水中。記錄逃避潛伏期，即從大鼠開(kāi)始尋找平臺(tái)直到爬至平臺(tái)上所用時(shí)間。如果1 min后，大鼠仍不能找到平臺(tái)，則實(shí)驗(yàn)員將其引至平臺(tái)上，此時(shí)逃避潛伏期只記為60 s。大鼠爬上平臺(tái)后在平臺(tái)上停留20 s，兩次訓(xùn)練間歇60 s休息時(shí)間，訓(xùn)練結(jié)束后迅速擦干大鼠。空間探索實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練第5天移除水下平臺(tái)，將大鼠由任一象限放入水中，觀察3 min自由游泳時(shí)間內(nèi)大鼠在目的象限（原平臺(tái)象限）的游泳時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)干預(yù)前，對(duì)所有組別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)的基線值進(jìn)行了測(cè)驗(yàn)，各組動(dòng)物的行為指標(biāo)相比無(wú)差異，表明各項(xiàng)行為指標(biāo)在暴露測(cè)試前條件均衡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重增幅比較 完成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹圃旌?，SH組大鼠體重為（121.69±9.87）g，C組為（120.59±8.42）g，F(xiàn)H 組（119.87±8.69）g，SL 組（119.73±10.19）g，F(xiàn)L組（123.79±12.17）g，各組間大鼠的體重變化比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表示兩種納米顆粒物并未對(duì)體重造成很大影響。

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 穿行格數(shù)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SH、FH組與C組相比較，均明顯減少，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.312、4.005，P＜0.05）；而低劑量?jī)山M（SL組、FL組）分別與C組進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然有減少趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。直立次數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SH組、FH組與C組進(jìn)行比較，直立次數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.367、5.091，P＜0.05）；而低劑量?jī)山M（SL組、FL組）分別與C組相比，雖然有減少趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。修飾次數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SH組、FH組與C組相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.578、0.108，P＞0.05）。大便粒數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SH組、FH組與C組相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.441、0.487，P＞0.05）。見(jiàn)表1。說(shuō)明兩種納米物質(zhì)高劑量組對(duì)大鼠的穿行格數(shù)、直立次數(shù)有較為明顯的影響，但是對(duì)修飾次數(shù)和大便粒數(shù)沒(méi)有明顯的影響。而低劑量組對(duì)大鼠的穿行格數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)及大便粒數(shù)四項(xiàng)測(cè)試均沒(méi)有明顯的影響，因此說(shuō)明納米顆粒物劑量達(dá)到一定水平時(shí)，對(duì)大鼠的穿行格數(shù)及直立次數(shù)有直接的影響。

表1 各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)間結(jié)果比較（±s）

表1 各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)間結(jié)果比較（±s）

*與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別 穿行格數(shù)（格） 直立次數(shù)（次） 修飾次數(shù)（次） 大便粒數(shù)（粒）C 組（n=8） 79.21±21.28 13.00±3.65 2.96±0.78 2.77±0.63 SL 組（n=8） 68.58±9.66 9.70±2.93 2.39±0.74 3.14±0.97 SH 組（n=8） 44.60±8.17* 6.93±1.46* 3.17±0.67 2.94±0.89 FL 組（n=8） 64.89±9.96 9.78±1.95 2.26±0.59 2.33±0.65 FH 組（n=8） 46.60±9.05* 5.97±1.39* 3.01±1.05 2.94±0.76

2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.3.1 定位航行試驗(yàn) 隨著訓(xùn)練的不斷增加，各組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短。實(shí)驗(yàn)高劑量組大鼠每天逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于C組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而實(shí)驗(yàn)低劑量組大鼠較對(duì)照組增長(zhǎng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，大鼠在逃避潛伏期時(shí)間上，SH組與C組Day1、Day2、Day4進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.665、2.361、3.049，P＜0.05），Day3兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。FH組與C組Day1、Day2、Day4進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.402、2.12、4.185，P＜0.05），Day3兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而SL組、FL組分別與對(duì)照組進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)續(xù)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期結(jié)果比較[s，（±s）]

表2 各組水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期結(jié)果比較[s，（±s）]

*與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別 Day1 Day2 Day3 Day4 C組（n=8） 29.93±4.15 10.54±5.49 6.47±2.09 2.46±0.98 SL組（n=8） 29.85±5.27 11.17±7.79 7.03±1.86 2.87±0.68 SH組（n=8） 37.16±3.73*16.59±4.73*9.41±3.52*5.79±2.93*FL組（n=8） 30.73±8.49 11.68±5.79 6.43±2.69 2.73±1.19 FH組（n=8） 38.79±9.57*17.31±7.17*9.45±5.17*6.01±2.19*

2.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 測(cè)試目標(biāo)象限游泳時(shí)間 顯 示，SH 組 為（87.13±10.93）s，C組 為（103.55±17.64）s，F(xiàn)H 組（90.63±8.73）s，F(xiàn)L 組（102.04±15.74）s，SL組（99.61±9.76）s， 實(shí) 驗(yàn)高劑量組大鼠目標(biāo)象限游泳時(shí)間明顯短于C組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而其他兩組低劑量組分別與C組進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此說(shuō)明兩種納米物質(zhì)的劑量的高低，對(duì)大鼠目標(biāo)象限游泳時(shí)間有直接的影響。

3 討論

納米顆粒在物理化學(xué)領(lǐng)域中有著其獨(dú)特的作用，普遍在很多領(lǐng)域都有使用，人們與納米顆粒物接觸的機(jī)會(huì)較多，而納米顆粒的安全性也越來(lái)越受到人們的關(guān)注[11]。由于人體最重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，會(huì)被納米顆粒物視為潛在的靶器官，納米顆粒物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成的毒性影響值得研究[12-13]。目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者通過(guò)對(duì)不同粒徑納米TiO2的研究，觀察其在大鼠體內(nèi)的分布和毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TiO2進(jìn)入大鼠體內(nèi)2周輕度地?fù)p害了大鼠的腦部，使海馬神經(jīng)元發(fā)生脂肪變性[14-15]。相關(guān)研究顯示，給予納米氧化鋁對(duì)大鼠鼻腔進(jìn)行不同劑量的滴注后，對(duì)其分別進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠的記憶力和學(xué)習(xí)能力出現(xiàn)了減退，而納米氧化鋁的毒性作用很大程度上是這些退化的主要因素[17]。

為了解大鼠的焦慮情況和探索學(xué)習(xí)能力，筆者通過(guò)曠場(chǎng)試驗(yàn)觀察得出了大鼠的應(yīng)激、活動(dòng)、興奮性和探究性行為。研究結(jié)果表明，納米顆粒物干預(yù)高劑量組中的大鼠探索行為能力和興奮性均有較明顯的降低，然而緊張程度卻相對(duì)較高，與對(duì)照組相比，適應(yīng)新環(huán)境的能力較差。在Morris水迷宮定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間均有所進(jìn)步，這一結(jié)果表明，大鼠能夠在一段時(shí)間的訓(xùn)練后準(zhǔn)確地找到水下平臺(tái)[18-20]。

本研究結(jié)果表明，納米顆粒干預(yù)高劑量組大鼠與對(duì)照組大鼠相比對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)性較差，具體表現(xiàn)為探索行為與興奮性降低，緊張程度則有所提高。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠的定位航行實(shí)驗(yàn)中，逃避潛伏期均逐漸縮短，表明大鼠可以經(jīng)過(guò)學(xué)習(xí)訓(xùn)練來(lái)準(zhǔn)確地尋找到水下平臺(tái)，但學(xué)習(xí)記憶能力存在明顯差異。大鼠的記憶、學(xué)習(xí)能力尤其是記憶與空間學(xué)習(xí)能力通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)驗(yàn)較為準(zhǔn)確可靠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠通過(guò)胃灌而留存于體內(nèi)的納米顆粒物，能夠?qū)Υ笫蟮挠洃浟涂臻g學(xué)習(xí)能力造成影響，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水迷宮實(shí)驗(yàn)第三天兩組高劑量組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別與對(duì)照組進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），由于樣本量不夠大，不同納米物對(duì)大鼠造成的影響程度存在差異，是造成該結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的主要原因之一。

綜上所述，為評(píng)價(jià)納米顆粒物對(duì)大鼠神經(jīng)行為造成的影響，對(duì)Wister大鼠進(jìn)行了曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)以及Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，并發(fā)現(xiàn)劑量為100 mg/kg的納米顆粒物可以在一定程度上損傷大鼠的神經(jīng)行為。然而，由多種機(jī)制共同作用才會(huì)對(duì)神經(jīng)行為造成改變。因此，納米顆粒物作用于神經(jīng)行為并使其發(fā)生改變的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。