松樹蕈多糖磷酸化修飾工藝及其抗氧化活性

季舒婷，謝靜茹，趙 培，劉晶晶，陳義勇

（常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

松樹蕈（Tricholoma matsutake）又名松蕈、松口菇、松樹菌等，隸屬擔子菌亞門、口菇科、口蘑屬［1］.研究發(fā)現松樹蕈多糖(Polysaccharides from tricholoma matsutake,TMP) 具有抗腫瘤［2］、美白［3］和抗輻射［4］等作用，具有廣闊的市場開發(fā)前景.分子修飾對多糖活性有很大的影響，對多糖進行化學修飾，可以提高多糖的活性［5］.磷酸化修飾是糖類物質的一種常見的修飾方法，但是目前關于松樹蕈多糖修飾研究鮮見報道.本文對TMP磷酸化修飾工藝進行優(yōu)化，并探討磷酸化松樹蕈多糖( Phosphorylated polysaccharides from tricholoma matsutake，P-TMP）的抗氧化活性，旨在為松樹蕈多糖的研究和開發(fā)提供理論基礎.

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

松樹蕈（蘇州興福齋食品科技有限公司提供）；1,1-二苯基-2-苦苯肼、三羥甲基氨基甲烷（上?？笊锛夹g有限公司）；三聚磷酸鈉(STPP)、三偏磷酸鈉(STMP)、磷酸二氫鉀、氯化鎂、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、過氧化氫、維生素C、硫酸、鉬酸銨等試劑均為市售分析純.

1.2 儀器

ME104E型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；DJ-04粉碎機（上海淀久中藥機械制造有限公司生產）；HH-2 智能數顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；RE-52A 型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；752型紫外-可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；SHB-B循環(huán)水式真空泵（鄭州長城科工貿公司）； DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司）；CR22GⅡ高速冷凍離心機（日本HITACHI公司）.

1.3 實驗方法

1.3.1 松樹蕈多糖（TMP）的提取

將松樹蕈洗凈、干燥、粉碎、過60目篩，按料液比1∶40加入蒸餾水，在80 ℃條件下浸提4 h。將多糖提取液離心（4 500 r/min，10 min），取上清液.將上清液減壓濃縮至一定體積，加上清濃縮液五分之一體積的Sevage試劑（氯仿與正丁醇的體積比為4∶1，mL/mL）劇烈振蕩30 min，去除蛋白，加入4倍體積的95%乙醇，4 °C條件下靜置24 h，離心，沉淀經冷凍干燥后得到TMP.

1.3.2 磷酸化松樹蕈多糖制備［6］

將多聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉以質量比為 6∶1的比例加入蒸餾水溶解，然后加入10 mL TMP（濃度為0.01 g/mL），調節(jié)pH 和溫度設定值后進行磷酸化反應，反應完成后，置于截留分子量為3500 Da的透析袋中透析2 d，透析液經減壓濃縮后，用4倍95%乙醇醇沉24 h，沉淀經過冷凍干燥，得到磷酸化松樹蕈多糖.

1.3.3 磷酸根含量測定［7］

采用鉬藍比色法測多糖中的磷酸根含量，分別取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 mL不同濃度梯度磷酸根標準溶液于25 mL比色管中，依次加入去離子水至總體積5 mL，tris緩沖液、定磷試劑（同體積的20%質量分數Vc、3 mol/L硫酸與3%鉬酸銨均勻混合）后置于恒溫水浴鍋中加熱，冷卻后于660 nm處測吸光度值為縱坐標，橫坐標為磷酸根濃度，繪制磷酸根標準曲線，如圖1所示.

圖1 磷酸根標準曲線

稱取磷酸化松樹蕈多糖0.5 g，于600 ℃高溫下灰化2 h，加入0.5 mL HCl溶液（蒸餾水與HCl體積比為1∶1），溶解灰化殘渣，將灰化樣品溶液移入10 mL的容量瓶中定容后，吸取溶液1 mL于25 mL比色管中，按標準曲線繪制方法測得吸光度，根據以下公式計算磷酸根含量.

磷酸根含量=（0.217 5A-0.007 5）/S ×100%

式中，A為樣品在660 nm處測得的吸光度，S為樣品的質量（g）.

1.3.4 單因素試驗

（1）磷酸化試劑比例對磷酸化反應的影響

準確稱取松樹蕈多糖樣品0.5 g，選用三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉的質量比例分別為6∶1，5∶2，4∶3，3∶4，2∶5，1∶6的磷酸化試劑，在pH6.0、反應溫度70 ℃的條件下與多糖反應3 h，考察磷酸化試劑比例對磷酸化反應的影響，確定最佳磷酸化試劑比例.

（2）反應溫度對磷酸化反應的影響

準確稱取松樹蕈多糖樣品0.5 g，在pH6.0、溫度分別為30，50，70，90，100 ℃的條件下與磷酸化試劑（三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉的質量比例為5∶2）反應3 h，考察反應溫度對磷酸化反應的影響，確定最佳反應溫度.

（3）反應pH對磷酸化反應的影響

準確稱取松樹蕈多糖樣品0.5 g，在溫度70 ℃、pH分別為5，6，8，9，10，11的條件下與磷酸化試劑（三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉的質量比例為5∶2）反應3 h，考察反應pH對磷酸化反應的影響，確定最佳反應pH.

（4）反應時間對磷酸化反應的影響

準確稱取松樹蕈多糖樣品0.5 g，在pH9.0、反應溫度70 ℃條件下與磷酸化試劑（三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉的質量比例為5∶2）反應，反應時間分別為2，3，4，5，6 h，考察反應時間對磷酸化反應的影響，確定最佳反應時間.

1.3.5 響應面試驗

在上述單因素實驗的基礎上，以磷酸根含量為指標，磷酸化試劑比例、溫度、時間、pH為自變量，根據Box-Benhnken Design中心組合試驗設計原理，設計四因素三水平的響應面分析實驗，研究磷酸化反應最佳工藝條件.

1.3.6 紅外光譜分析

分別取一定量充分干燥的TMP和P-TMP，與一定量KBr充分混勻后壓片，在波數4 000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描，比較TMP與P-TMP的紅外光譜.

1.3.7 松樹蕈多糖的體外抗氧化活性

（1）對DPPH自由基清除作用的測定［8］

分別取不同濃度（20，50，100，150，200 μg/mL）的TMP和P-TMP多糖溶液2 mL，與2 mL 0.1mmol/L DPPH（避光，現配現用）室溫混勻，避光反應30 min后，在517 nm處測吸光度.以無水乙醇替代樣液作空白對照，按如下公式計算清除率.

DPPH自由基清除率=［1-（Ai-Aj）/Ao］×100%

式中：Ai為多糖樣液加DPPH溶液的吸光度；Aj為樣液加無水乙醇的吸光度；Ao為乙醇加DPPH溶液的吸光度.

（2）超氧陰離子自由基清除作用的測定［9］

分別取不同濃度（20，50，100，150，200 μg/mL）的TMP和P-TMP多糖溶液1.0 mL置于試管中，加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH8.2）和3.2 mL蒸餾水搖勻，在25 ℃條件下水浴10 min，然后加入10 mmol/L的0.1 mL鄰苯三酚作為樣品組，空白組以0.3 mL 10 mmol/L HCI代替鄰苯三酚，充分搖勻，反應3 min后（以加入鄰苯三酚時開始計時），立即加入1滴10 mol/mL的HCl溶液終止反應，在325 nm處測定吸光度，實驗重復3次，按下式計算超氧陰離子自由基的清除率.

式中，A為樣品組測得的吸光度，A0為空白組測得的吸光度.

（3）羥基自由基（·OH） 清除作用的測定［10］

分別取不同濃度（20，50，100，150，200 μg/mL）的TMP和P-TMP多糖溶液2 mL，分別加入1 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）和2 mL水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L），最后加入2 mL H2O2（8.8 mmol/L）啟動反應，在25 ℃條件下反應1 h.用蒸餾水代替樣品溶液作空白，在510 nm波長處測定吸光度，實驗重復3次，根據以下公式計算羥基自由基的清除率.

其中，A0為標準空白管的吸光度，A1為對照管的吸光度，A2為測定管的吸光度.

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 磷酸化試劑比例對磷酸化反應的影響

圖2 磷酸化試劑比例對磷酸根含量的影響

磷酸化試劑比例對磷酸化反應的影響見圖2，由圖2可知，添加不同比例的磷酸化試劑所得多糖的磷酸根含量明顯不同.當磷酸化試劑比為5∶2時，磷酸根含量最高為4.134%.因此選擇合適的磷酸化試劑比為5∶2.

2.1.2 溫度對磷酸化反應的影響

溫度對磷酸化反應的影響見圖3，由圖3可知，當溫度在30～90 ℃之間，隨著溫度的升高，磷酸根含量不斷升高，這可能是因為溫度升高使高分子鍵的活性增強，磷酸化試劑利用率隨之增加［11］.當溫度達到90 ℃時，磷酸根含量達到最高值為6.618%.當溫度繼續(xù)升高，磷酸根含量反而降低，其原因可能是溫度過高會對多糖分子結構造成破壞，使其降解［6］.因此選擇合適的反應溫度為90 ℃.

圖3 溫度對磷酸根含量的影響

2.1.3 時間對磷酸化反應的影響

時間對磷酸化反應的影響見圖4，從圖4可以看出，隨著時間的增加，多糖磷酸根含量也不斷增加，當時間為5 h時，達到最大值為7.106%.時間進一步增加，磷酸根含量反而下降，可能是因為多糖在較高的溫度下反應時間過長，導致多糖降解，從而磷酸根含量減少［6］.因此選擇5 h為適宜的反應時間.

圖4 時間對磷酸根含量的影響

2.1.4 pH對磷酸化反應的影響

pH對磷酸化反應的影響見圖5，由圖5可知，當pH為9.0時，磷酸根含量達到最大值7.529%.當pH小于9時，磷酸根含量隨著pH的升高而升高.當pH大于9.0時，磷酸根含量隨著pH的升高而降低.其原因可能是在較低pH條件下，三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉不穩(wěn)定，會分解生成焦磷酸鈉和正磷酸鈉，使多糖磷酸根含量降低.而pH過高時可能磷酸化試劑和多糖發(fā)生酯化反應進而對磷酸化反應產生不利影響［12］.因此選擇適宜的pH為9.

圖5 pH對磷酸根含量的影響

2.2 響應面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應面因素水平的選取及實驗設計

在單因素實驗結果的基礎上，以磷酸化試劑比例（A）、溫度（B）、時間（C）、pH（D）為自變量，磷酸化松樹蕈多糖中磷酸根含量為響應值，設計四因素三水平的響應面分析試驗，探討自變量與響應值之間的函數關系.試驗的因素和水平見表1.

表1 響應面設計因素水平表

2.2.2 模型的建立與分析

松樹蕈多糖磷酸化的響應面試驗設計及結果見表2，通過使用design-expert軟件對表2數據進行擬合，得到松樹蕈磷酸化多糖對磷酸化試劑比例（A），溫度（B），時間（C）和pH（D）的二次多項回歸方程的模型：Y=9.64-0.092A-0.79B+0.073C-0.29D-0.092AB-0.45AC-0.29AD-0.035BC+0.053BD-0.092CD-0.50A2-1.35B2-0.60C2-0.33D2.

表2 松樹蕈多糖磷酸化的響應面試驗設計及結果

表3 回歸方程方差分析結果

響應面分析方差結果見表3.該模型的F值為20.49，P<0.000 1，說明擬合的模型達到極顯著的水平；模型的決定系數R2=0.953 5，表明該模型的擬合程度較好，用于評估各因素對松樹蕈多糖磷酸根含量的影響較為準確.

從表3還可以看出，試驗組合中的各因素中溫度（B）、pH（D）均具有極顯著水平（P<0.05），其中溫度為最大的影響因素.影響程度大小的因素順序為：溫度（B）>pH（D）>磷酸化試劑比例（A）>時間（C）.

2.2.3 響應面圖形分析

試驗得到的響應面圖見圖6.在曲面圖中，通過圖形可以直觀地看出因素間的交互作用，坡度越大，影響越顯著，反之則影響較小.從圖6分析得出，磷酸化試劑比例（A）與溫度（C）的交互作用顯著，其余交互作用影響不大.

2.2.4 模型的優(yōu)化及驗證實驗

通過Design-Expert軟件對實驗進行優(yōu)化，按照回歸模型預測可得到松樹蕈多糖磷酸化的最佳工藝條件為：磷酸化試劑比例為5.03∶1.97，溫度為86.98 ℃，時間為5.10 h，pH8.51，在此反應條件下得到的多糖磷酸根含量9.829 9%.為了驗證此結果的可行性，根據實際情況修改工藝條件為：磷酸化試劑比例為5∶2，溫度86 ℃，時間5.1 h，pH9.0，在該條件下進行3次平行實驗測得多糖磷酸根含量平均值為9.703%，該值與模型預測值很接近，驗證了該預測試驗的可靠性.

圖6 兩因素交互作用對磷酸根含量的影響

2.3 紅外光譜

對TMP及P-TMP在4 000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描，結果如圖7所示，可以發(fā)現其變化趨勢和吸收峰變化不大，都在3 423 cm-1處出現-OH的伸縮振動吸收峰，在2 922 cm-1處出現-CH2的伸縮振動吸收峰，1 619 cm-1出現C=O的振動收縮峰，在1 400處出現吸收峰是因為C-H的伸縮振動.磷酸化后在1 262 cm-1處出現特征吸收峰是P=O伸縮振動產生的，997 cm-1附近的吸收峰是P-O-C的伸縮振動峰，說明磷酸化修飾成功，磷酸化衍生物成功接上磷酸基.

圖7 TMP及P-TMP的紅外光譜圖

2.4 松樹蕈多糖抗氧化活性

2.4.1 對DPPH自由基的清除作用

TMP及P-TMP對DPPH自由基的清除作用見圖8.由圖8可知，TMP及P-TMP都對DPPH自由基具有清除作用，且隨著多糖質量濃度的升高，清除能力也隨之增強，并呈正相關.與TMP相比，經過磷酸化修飾的多糖P-TMP對DPPH自由基的清除作用明顯增強.原因可能是多糖經過磷酸化后其水溶性提高，糖鏈的構象發(fā)生改變，進而影響多糖的生物活性［13］.

圖8 TMP及P-TMP對DPPH自由基的清除作用

2.4.2 對超氧陰離子自由基的清除作用

TMP及P-TMP對超氧陰離子自由基的清除作用見圖9.由圖9可知，在一定濃度范圍內，TMP及P-TMP對超氧陰離子自由基均具有清除作用，并且與濃度呈正相關.隨著濃度的升高，其清除能力增強.與TMP相比，經過磷酸化修飾的多糖P-TMP清除能力明顯減弱，其可能原因是磷酸根基團的存在改變了化合物的極性，從而導致活性的改變.

圖9 TMP及P-TMP對超氧陰離子自由基的清除作用

2.4.3 對羥自由基的清除作用

TMP及P-TMP對羥自由基的清除作用如圖10所示.由圖10可知，TMP及P-TMP對羥自由基都均有較強的清除作用，在一定濃度范圍內，隨著多糖質量濃度的提高，其清除自由基能力隨之增強，P-TMP對清除羥自由基的能力明顯強于TMP，其可能原因是TMP經過磷酸化修飾后導致分子結構發(fā)生改變，提高了其阻止·OH發(fā)生連鎖反應的能力.

圖10 TMP及P-TMP對羥自由基的清除作用

3 結論

以松樹蕈為原料，通過熱水浸提法提取松樹蕈多糖，以磷酸根含量為指標，探討磷酸化試劑比例（即三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉的質量比，g/g）、溫度、時間、pH對松樹蕈多糖磷酸化修飾的影響.在單因素實驗基礎上，通過響應面優(yōu)化松樹蕈多糖磷酸化修飾條件，并比較修飾前后松樹蕈多糖的抗氧化活性.結果表明：松樹蕈磷酸化修飾最佳工藝條件為磷酸化試劑比例5∶2，溫度86 ℃，時間5.1 h，pH9.0，在該工藝條件下，磷酸化松樹蕈多糖衍生物的磷酸根含量為9.703%.抗氧化結果表明：TMP及P-TMP對DPPH、超氧陰離子自由基、·OH自由基均有一定的清除作用，且在一定質量濃度范圍內呈正相關，同TMP相比，P-TMP清除超氧陰離子自由基能力有所下降，但對DPPH及·OH自由基清除能力有所增強.