食用菌中多酚抗炎功能研究進展

張嘯怡,李忠海,任佳麗

(中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院,稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室,湖南長沙 410004)

食用菌不僅因其鮮美的味道受到人們的青睞,而且具有多種生物醫(yī)學功能,如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗心血管疾病、抗細菌、保肝、解毒、抗糖尿病和其他很多的生理功能[1-3]。我國食用菌的產(chǎn)量十分豐富,在2013年已經(jīng)達3169.7萬噸,占到了全球總產(chǎn)量的70%以上[4],因此受到廣大研究者的青睞。在近年的報道中,發(fā)現(xiàn)食用菌含有許多具有抗炎作用的生物活性物質(zhì),包括多糖[5]、酚類[6-9]、倍半萜類、甾醇類[10-11]等。盡管許多物質(zhì)可能參與到抗炎作用中來,但酚類很大程度上被看作有抗炎作用的主要自然物質(zhì),不同食用菌提取物中的總酚含量與抗炎效果之間是正相關(guān)的[12-13]。酚類物質(zhì)是菌類產(chǎn)生的具有生理功能的次生代謝產(chǎn)物,酚酸雖然是酚類中含量最為豐富的分支,但是它們的提取物中的含量與抑制炎癥的能力并不相關(guān),這意味著酚類中的其它物質(zhì)在抗炎中起到了關(guān)鍵的作用,Carlos Moro認為可能是焦倍酸在其中起著了關(guān)鍵作用,而其它的包括酚酸和黃酮在內(nèi)的其它多酚類物質(zhì)可能與其有協(xié)同作用[7]。但這與Oludemi Taofiq等[6]在得出的結(jié)論肉桂酸等具有較好的抗炎效果相悖。對食用菌中酚類具體何種物質(zhì)的具有較強的抗炎作用或該物質(zhì)與其他酚類的協(xié)同作用的研究,可以促進我們對食用菌中的多酚抗炎機制的認識,并為開發(fā)具有抗炎功效的食用菌保健食品提供理論支撐。

1 多酚及其提取純化分離

多酚類物質(zhì)指的是一類至少存在一個六元環(huán)而且存在一個或多個羥基官能團的物質(zhì)[14]。多酚大體上可分為兩大類:一大類是多酚單體,另一大類則是由單體聚合而形成的低聚或多聚體[15]。多酚的提取主要采用溶液萃取法。食用菌中的多酚提取可以采用的溶劑有很多的選擇:甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水等,Taofiq等[6]在對比各種不同溶劑的食用菌提取物的抗炎活性的影響后發(fā)現(xiàn)由乙醇作為提取劑提取出來的物質(zhì)的抗炎活性較甲醇高,且乙醇價格也較為合理。為了提高提取的效率和縮短提取的時間,經(jīng)常采用超聲波輔助提取或微波輔助提取以達到最佳效果。在多酚純化過程中,由于多酚類物質(zhì)有較大的極性,較差的穩(wěn)定性,且易氧化,因此很少用到正向硅膠分離純化,一般采用以凝膠、樹脂等柱色譜法來分離多酚[16]。要分離多酚類化合物,一般需采用半制備的高效液相色譜(HPLC),半制備的HPLC色譜分離結(jié)果較好。

2 炎癥機理

炎癥是生物從機體移除有害毒素或者病原體的重要的生物反應。在炎癥反應中,巨噬細胞,單核細胞和其他一些炎性細胞分泌炎癥因子。它們是特殊的細胞,通過吞噬作用來消化細胞殘骸、細菌和癌細胞。它們在非特異性主動防御中有極其重要的作用,而且也可以激活其他防御機制。吞噬細胞除了激活免疫系統(tǒng)外還在炎癥的響應中有極為重要的作用,他可以通過釋放各種因子來促發(fā)炎癥。當炎性細胞被暴露在脂多糖或病毒蛋白時,它們受到刺激而促使這些炎癥因子的產(chǎn)量上升[17]。實驗中一般采用脂多糖來誘導巨噬細胞,使其炎癥因子分泌增多,根據(jù)提取物質(zhì)對炎癥因子的影響,便可得到該物質(zhì)的抗炎活性。炎癥的作用的信號通路圖1如下,在巨噬細胞膜上的受體,Toll樣受體4(TLRs4)和TNFR受體識別脂多糖(LPS)和腫瘤致死炎癥α(TNF-α)[18-19],LPS和TLR4之間的互相作用導致髓樣分化因子88(MyD88)和TRIF信號通路的激活,TNF-α與TNFR的相互作用導致TRAF信號通路被激活[20-22]。當這些信號通路被激活后,它們能夠激活I(lǐng)KK激酶(IKKα、IKKβ、IKKγ)。IKK激酶進一步的使NF-κB復合物磷酸化導致IκB上的Lys48發(fā)生多聚泛素化[23],從而進一步的被蛋白酶體降解,當IκB降解后,導致NF-κB從復合物中分離出來,此時的NF-κB能轉(zhuǎn)運到核內(nèi),然后連接到特殊的DNA序列上來編碼促炎因子(IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α)以及產(chǎn)生次級炎癥介質(zhì)的酶,如環(huán)氧酶-2(COX-2)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等。iNOS催化L-精氨酸(L-Arg)產(chǎn)生信號分子NO,NO調(diào)節(jié)著炎癥級聯(lián)反應中的許多步驟,特別是在在炎癥的發(fā)生和信號轉(zhuǎn)導[24]。NO通過Ca離子通道來誘導心血管系統(tǒng)中心血管舒張,并且誘導神經(jīng)系統(tǒng)細胞的死亡[25]。NO作為炎癥因子,由于其測定想多的較為方便,經(jīng)常在被用來作為檢測物質(zhì)抑炎作用程度[3,6,7,25-28]。一些多酚已經(jīng)被證實抑制特定的步驟導致抑制NF-κB的釋放,從而在炎癥因子相對于的基因的表達減少,炎癥因子分泌減少[29]。

圖1 核因子-kB(NF-kB)途徑示意圖Fig.1 Schematic diagram of nuclear factor-kB(NF-kB)pathway

3 食用菌中多酚的抗炎功能

植物和食用菌均能夠制造很多的次生代謝產(chǎn)物,而多酚類是這些產(chǎn)物中最重要的組分之一。它在抗炎方面的生理功能也越來越受到重視,表1展示了近些年來一些從食用菌中分離出來的酚類或其衍生物具有抗炎活性的依據(jù)。

表1 各種食用菌中酚類物質(zhì)及其衍生物的抗炎作用Table 1 Phenolic compounds and derivatives isolated from mushrooms with reported anti-inflammatory potential

雙胞蘑菇又稱白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇,歐美各國生產(chǎn)經(jīng)營者常稱之為普通栽培蘑菇或紐扣蘑菇。雙孢蘑菇是世界性栽培和消費的菇類。Kohno等[30]發(fā)現(xiàn)從雙孢褐色蘑菇中提取出來的2氨基-3H-吩惡嗪-3-酮(APO)具有抗炎活性。經(jīng)過促炎癥因子LPS/IFN-γ刺激的小鼠腹腔巨噬細胞后,APO抑制NO的產(chǎn)生的半抑制濃度IC50=1.5 μmol/L,而其對前列腺素E2(PGE2))的半抑制濃度IC50=0.27 μmol/L,數(shù)據(jù)分析顯示APO對環(huán)氧合酶-1(COX-1)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)酶的活性的抑制有相近的選擇性。

牛樟芝是臺灣特有的真菌,僅生長于臺灣特有的牛樟樹上。一些從牛樟芝中分離的苯型烴類及其衍生物已經(jīng)測定具有抗炎活性[9]。從牛樟芝中分離的三種苯型烴類化合物能夠抑制經(jīng)過LPS刺激處理過的巨噬細胞分泌的NO的產(chǎn)生,這三種化合物是3-異丙烯-2-甲氧基-6-甲基-4,5-亞甲二氧基-酚、4,4′-二羥基-3,3′-二甲氧基-2,2′-二甲基-5,6,5′,6′雙亞甲基脫氧聯(lián)苯、2,3-亞甲二氧基-4-甲基-5-甲酚,他們的IC50分別是(1.8±0.2)、(18.8±0.6)、(0.8±0.3) μg/mL。其他從牛樟芝中分離出來的酚類因有較好的抗炎效果[31],能夠抑制NO和PGE2的產(chǎn)生,并能在轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平上抑制iNOS和COX-2的表達。

粒狀大團囊菌是子囊菌綱,曲霉目,大團囊科的一種使用真菌。在對粒狀大團囊菌子實體的乙醇提取物的研究中發(fā)現(xiàn)當提取物濃度為50 μg/mL時,其對COX-2的抑制程度達到了68%。

通過生物活性追蹤發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)且被證實的兩種活性物質(zhì)分別為丁香醛和丁香酸,丁香醛對COX-2的半抑制濃度IC50=3.5 μg/mL,丁香酸對COX-2的半抑制濃度IC50=0.4 μg/mL[32]。

淡黃木層孔菌是一種藥用蘑菇,屬于刺革菌科真菌,其生長周期短,一般在3個月作用。Chang,Gebru等[33]用乙酸乙酯提取淡黃木層孔菌發(fā)現(xiàn)提取物對LPS誘導產(chǎn)生的NO和COX-2 mRNA的表達有較強的的抑制作用。6種被認證的主要產(chǎn)物中原兒茶醛起到了主要的作用。

櫟迷孔菌,屬多孔菌科一種,是木棲腐生的中小型菇類,該菇類生長于如臺灣等地低中海拔林區(qū)。其具有抗炎作用,從其菌絲體提取的物質(zhì)經(jīng)過生物導向分離得到的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式為(-)-(2S)-2-羥甲基-2-甲基-6-羥基苯并吡喃。該成分在很小的濃度下就具備較高的抗炎活性,能有效的抑制COX-2的產(chǎn)生[34]。

潔麗香菇,來源為為側(cè)耳科植物潔麗香菇的全草,具有補益氣血的功效。在研究潔麗香菇的次生代謝產(chǎn)物的生理活性時發(fā)現(xiàn)了兩種新的次生代謝產(chǎn)物[35],5-甲氧基苯并呋喃-4,7-二酮和1,3-二氫泵并呋喃-4,6-二醇,還有苯醌衍生物一種和6種肉桂酸的衍生物。5-甲氧基苯并呋喃-4,7-二酮對NO的半抑制濃度IC50=6.2 μg/mL。

Taofiq等[6]研究雙孢蘑菇、平菇、松乳菇等十四種野生食用菌的乙醇提取物的抗炎活性,發(fā)現(xiàn)提取物活性成分化學特征上是酚酸或與其相關(guān)的物質(zhì)。這些物質(zhì)是對羥基苯甲酸、對香豆酸、和肉桂酸以及它們糖基化和甲基化的衍生物,并且發(fā)現(xiàn)通過化學合成的這些物質(zhì)同樣具有相對性的活性。平菇、高大環(huán)柄菇、黃褐牛肝菌、雙孢蘑菇提取物的抗炎活性較高,其半抑制濃度從(96±1)～(190±6) μg/mL。

Moro等[7]研究雙孢蘑菇、雞油菌、松乳菇等6種食用菌,發(fā)現(xiàn)其提取物中抗炎活性較高的物種有雙孢蘑菇、雞油菌、松乳菇具有較高的抗炎活性,這幾種菌能夠抑制NO的產(chǎn)生,也能抑制iNOS、IL-1β和IL6 的mRNA的表達。

4 多酚抗炎研究方法

4.1 NO的檢測方法

NO是炎癥反應與免疫調(diào)節(jié)的效應因子,同時也是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。NO參與到各種炎癥信號的傳導,與各種炎癥因子之間存在著相互作用。NO在炎癥反應進程中的各個階段都有產(chǎn)生,因此,可以測定細胞內(nèi)NO的含量來判斷某一研究的物質(zhì)是否具有抗炎活性,固Griess反應被廣泛運用在定量的測定NO上[24]。這個基本的反應涉及到磺胺和N-(萘基)乙二胺(NED)來組成穩(wěn)定的偶氮物質(zhì)。這個物質(zhì)的吸光度在540 nm,在該波長處樣本中的亞硝酸鹽濃度呈正比。許多體外測定經(jīng)過LPS刺激RAW264.7細胞產(chǎn)生的NO已被證實[6,37-38]。NO的電化學氧化產(chǎn)物NO+是能被還原的,正反應:NO-e→ NO+逆反應:NO++e→NO,因此我們能夠使用電化學的方法來測定細胞和溶液中的NO的含量[39]。其中有兩種較為實用的電化學方法:Clark電極法[40]的原理是利用小分子NO易被氧化的特性,使其在電極表面氧化產(chǎn)生電流,此電流可用安培表測出,而在體外一個小范圍內(nèi)(1～3×10-6mol/L),電流與NO濃度呈線性比例關(guān)系。該方法可以用于檢測局部組織產(chǎn)生的NO,靈敏度較高(10-9mol/L),反應速度快(幾秒鐘)。其缺點是空氣中的氧也能參與到反應中,從而對NO生成的電流信號的真實性產(chǎn)生干擾;聚合卟啉微感器法[40-41]是將卟啉化合物沉積在玻碳上,卟啉環(huán)內(nèi)結(jié)合有金屬離子Ni(II),NO與卟啉環(huán)中的Ni(II)配位,導致膜電位發(fā)生改變,從而可以由此測得NO含量。該法檢測NO閾值可達10～20 mol/L,線性反應濃度高達3×10-4mol/L,其特異性也很高,可以測定單獨一個細胞所產(chǎn)生的NO的量,該方法最適合用于測定NO釋放的動力學的研究。用電化學這種方法的特點就是它可以在原位直接檢測活體樣本的NO,并且能夠?qū)崿F(xiàn)實時監(jiān)控測定。檢測細胞NO的產(chǎn)生是非常簡便及高效的方法,經(jīng)濟實用,但通常需與其它指標一起檢測來達到驗證效果。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附劑實驗(ELISA)法

ELISA法是用來檢測和量化細胞分泌或釋放的蛋白的一種方法,經(jīng)常被用在測定抗炎活性中,用來測定炎癥因子的含量,如白介素(IL-1β、IL-6、IL-8)和腫瘤致死因子(TNF-α)就可通過該方法測定出來[28,42-43]。通常將培養(yǎng)RAW264.7細胞的上清液收集起來,根據(jù)ELISA試劑盒產(chǎn)商提供的操作流程來檢測上述炎癥炎癥的含量。這種方法利用保持其免疫活性的抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,然后與某種特定的酶連接形成酶標抗原或抗體,它同時保留了免疫活性和酶的活性。在測定時,把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。將固相載體上的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)用洗滌的方法將其分開,最后如果結(jié)合在固相載體上的酶量越多,那么表示待測標本中受檢物質(zhì)的量也越多。在其中加入與作用的底物后,底物就可被酶催化變?yōu)橄鄳挠猩漠a(chǎn)物,可以根據(jù)顏色的深淺作定量的分析。酶可非常大地放大反應效果,因此使用ELISA能有很高的敏感度[44]。ELISA法靈敏度較高,能探測到不同炎癥因子的量的變化,能有效的驗證抗炎活性。

4.3 實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)法

提取組織或細胞中的總的RNA,以炎癥因子iNOS、TNF-a、IL-1β和IL-6基于其表達的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或者隨機引物,然后利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行擴增,從而獲得檢測基因表達。RT-PCR是可以定性的,但并不能進行定量檢測的,而RT-qPCR 就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的RT-PCR,先從 RNA 反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA(RT),然后再用 Real-time PCR進行定量分析(qPCR)。盡管該方法可達到快速、敏感和準確的量化,但不同控制條件下的分析必需采用可靠的方法[45]。

4.4 機體水平的實驗法

在動物實驗模型中毛細腫脹,血壓升高,水腫這些現(xiàn)象與人類嚴重的炎癥時的現(xiàn)象類似[46]。動物體內(nèi)誘導的炎癥發(fā)生的程度與腫脹呈正相關(guān),機體水平的實驗一般采用小鼠作為實驗對象。在小鼠機體炎癥機理的研究中基本上用到二甲苯誘導的小鼠耳腫脹法[47]、卡拉膠誘導的小鼠腹腔炎法[48]、大鼠棉球肉芽腫法這三種方法。小鼠耳腫脹法是先將多酚給予小鼠灌胃一段時間后,用等量的二甲苯涂于小鼠右耳(二甲苯有誘導小鼠腫脹功能),左耳對照,處理一段時間后,用打孔器取中央位置稱其重量,左右耳的重量差值就是腫脹度;卡拉膠誘導小鼠腹腔炎法同樣先將所研究物質(zhì)(陽性對照為吲哚美辛)灌胃小鼠處理一段時間后,再注射卡拉膠生理鹽水,處死老鼠后用磷酸緩沖液洗滌腹腔,收集洗滌液,并測定其中白細胞的數(shù)量;大鼠棉球肉芽法是先將大鼠麻醉后將一定量的無菌棉花球塞入大鼠兩側(cè)腋下,大鼠服用一定時間多酚(陽性對照為吲哚美辛)后,取出棉球,除去脂肪組織,將棉球烘干測定其重量。機體水平的實驗能夠更加直觀的認證細胞水平抗炎效果。

3 結(jié)語

食用菌廣泛分布于全世界,營養(yǎng)價值高,且中國是全球最大食用菌生產(chǎn)地,發(fā)展?jié)摿薮?。多酚是廣泛存在于食用菌中含量和種類豐富的一種次生代謝產(chǎn)物,其具有重要的抗炎功能。大量文獻都指出從食用菌中分離得到的多酚具有抗炎活性,并且某些食用菌中分離出的多酚的半抑制濃度僅僅只有幾微克每毫升,就能達到顯著的抗炎效果。通過對炎癥信號通路的解讀,得知，炎癥因子是炎癥的最直觀體現(xiàn),炎癥因子收到基因表達調(diào)控,因此細胞水平多酚抗炎研究方法就是對它們的含量變化進行檢測,動物機體則是觀察期形態(tài)變化。對于食用菌中具體何種多酚的抗炎作用說法不一,它們之間的相互作用更是幾乎沒有文獻談到。因此研究食用菌中多酚抗炎機制及它們之間的相作用具有重要意義。