一氧化氮對常溫貯藏下芒果果實軟化 和細胞壁代謝的影響

何俊瑜,任艷芳,,*,陳元有,王艷玲,林 肖,劉 冬

(1.常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院,江蘇常州 213164; 2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院,貴州貴陽 550025)

芒果(MangiferaindicaL.)是世界上重要的熱帶水果,不僅風(fēng)味獨特、色澤誘人,而且富含多種營養(yǎng)成分,因此深受消費者喜愛,被譽為“果中之王”[1]。然而,芒果采后生理代謝依然十分旺盛,后熟軟化迅速,不僅導(dǎo)致果實品質(zhì)降低,而且軟化的果實更易引起病原微生物的侵染,給貯藏、運輸、銷售等環(huán)節(jié)帶來極大困難,造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。據(jù)估計,芒果從采收到消費階段,損失率可以達到25%～40%[3]。因此,采取有效措施延緩采后芒果軟化和品質(zhì)劣變,是目前芒果貯藏保鮮中亟待解決的重要問題。

一氧化氮(Nitric oxide,NO)是存在于植物體內(nèi)的一種重要的信號分子,其廣泛參與植物的生長、發(fā)育、成熟、衰老等生理過程[4-6]。近年來,有關(guān)外源NO調(diào)控果蔬成熟、抗病和保鮮的研究報道越來越多,已成為采后生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。已有研究表明,適宜濃度的NO處理可有效延緩桃子[7]、番茄[8]、木瓜[5]、荔枝[9]、香蕉[10]、柑橘[11]等采后果蔬的成熟衰老,延緩果實的褐變,維持果實貯藏品質(zhì)和提高其對采后冷害和病害的抵抗能力。此外,研究表明,NO可以通過調(diào)節(jié)果實中的細胞壁水解酶,如多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases,PG)、果膠甲酯酶(Pectin methylesterase,PME)、纖維素酶(Cellulose,CX)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)活性和基因的表達,從而延緩果實的軟化進程[8,13-16]。

目前,NO在芒果保鮮上的作用效果已有報道[17-19],但對于其在芒果后熟軟化和細胞壁代謝方面的研究報道還較為缺乏。本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上[1],研究SNP處理對芒果常溫后熟軟化和細胞壁代謝的影響,探討采后NO處理延緩芒果果實軟化的作用機理,旨在為采后芒果的貯藏保鮮提供的理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“臺農(nóng)”芒果(MangiferaindicaL. cv. Tainong) 貴陽市石板鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場,購買當天運回實驗室進行處理;硝普鈉(SNP)、柑橘果膠、D-(+)-半乳糖醛酸、羧甲基纖維素鈉、對硝基苯-α-D-阿拉伯呋喃糖苷、對硝基酚、對硝基苯-β-D-半乳糖苷 美國Sigma公司。

GY-1型水果硬度計 杭州托普儀器有限公司;HH-S6數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 金壇市國旺儀器廠;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;5804R型高速冷凍離心機 上海艾本德中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芒果果實的處理方法 選擇大小、成熟度基本一致(硬度14.4 kg/cm2,可溶性固形物8.5%)、無病蟲害、無畸形、無機械損傷、未經(jīng)過催熟處理的芒果果實,以0.5%次氯酸鈉溶液(有效氯≥10%)浸泡3 min,清水沖洗干凈。將挑選出的芒果果實隨機分為2組,分別置于清水(CK)和0.25 mmol/L SNP溶液中浸泡20 min后[1],自然晾干。將芒果果實裝入鋪有多層軟紙的塑料框中,于常溫(20±2 ℃)條件下貯藏20 d。每個處理60個果實,重復(fù)3次。貯藏期間每5 d取樣一次,每個重復(fù)取5個芒果,用于測定果實硬度、果膠物質(zhì)含量、纖維素含量和細胞壁水解酶活性。

1.2.2 相關(guān)指標的測定方法

1.2.2.1 硬度 果實硬度采用果實硬度計測定。單果取去皮赤道部位果肉4個點測定,取平均值,以kg/cm2表示。

1.2.2.2 果膠物質(zhì)含量 原果膠含量及水溶性果膠含量的測定采用咔唑比色法[20]。以半乳糖醛酸標品作標準曲線,y=0.5139x+0.2127(R2=0.9981),根據(jù)標準曲線計算半乳糖醛酸質(zhì)量,以樣品中生成的半乳糖醛酸質(zhì)量占樣品質(zhì)量的百分數(shù)(%)表示原果膠和水溶性果膠含量。

1.2.2.3 纖維素含量 纖維素含量測定采用蒽酮比色法[21]。以葡萄糖標品作標準曲線,y=0.031x+0.0306(R2=0.9987),根據(jù)標準曲線計算葡萄糖含量,以樣品中葡萄糖含量占樣品質(zhì)量的百分數(shù)(%)表示纖維素含量。

1.2.2.4 細胞壁水解酶 取果肉2.0 g,樣品放于冷凍過的研缽內(nèi),加入6 mL Tris-HCl溶液(50 mmol/L,pH7.0),內(nèi)含 2 mol/L NaCl、10 mmol/L EDTA 和 5 g/L(W/V)PVPP,冰浴上研磨勻漿,于4 ℃、12000 r/min離心20 min,取上清液用于酶活性測定。

PG活性的測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[20]。以D-(+)半乳糖醛酸為標樣作標準曲線,y=0.1061x-0.0388(R2=0.9995)。以每小時每克鮮樣37 ℃分解多聚半乳糖醛酸鈉產(chǎn)生1 mg游離半乳糖醛酸為1個PG活力單位(U),即表示為U/(h·g FW)。

PME活性的測定參考徐曉波[22]的方法。反應(yīng)液含有2 mL 0.5%柑橘果膠、0.3 mL 0.01%溴麝香草酚蘭,加水使總體積為3 mL,最后加入400 μL酶液,測定波長620 nm處吸光值。以每克鮮樣每分鐘620 nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位(U),即表示為U/(min·g FW)。

CX活性的測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[20]。以葡萄糖為標樣作標準曲線,y=0.1196x-0.0205(R2=0.9994)。以每毫升酶液每分鐘產(chǎn)生相當于1 mg葡萄糖的還原糖為1個酶活性單位(U),即表示為U/(h·g FW)。

β-Gal活性的測定參考Ali等[23]的測定方法。以對硝基酚為標樣作標準曲線,y=0.2238x-0.2101(R2=0.9998)。以每分鐘每克鮮樣37 ℃分解對硝基苯-β-D-半乳糖苷產(chǎn)生1 μmol對硝基酚量為1個β-Gal酶活性單位(U),即表示為U/(h·g FW)。

α-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase,α-L-Af)活性的測定參考Ali等[23]的測定方法。以對硝基酚為標樣作標準曲線,y=0.0623x+0.0137(R2=0.9989)。以每分鐘每克鮮樣37 ℃分解對硝基苯-α-D-阿拉伯呋喃糖苷產(chǎn)生1 μmol對硝基酚量表示為1個α-L-Af酶活性單位(U),即表示為U/(h·g FW)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析,p<0.05、p<0.01分別表示差異顯著、極顯著。采用Origin Pro 8.0 軟件繪制曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP對芒果果實硬度的影響

硬度是衡量果實軟化衰老程度的重要指標。圖1表明,貯藏期間芒果果實硬度呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。與貯藏前相比,在貯藏5 d時,對照和SNP處理中果實硬度分別降低了27.2%和14.9%。隨著貯藏時間的延長,對照和SNP處理的果實硬度迅速降低。然而與對照相比,整個貯藏期間,SNP處理顯著延緩了果實硬度下降的程度。至貯藏第20 d時,SNP處理中果實硬度為對照的3.0倍,極顯著高于對照(p<0.01)。這與NO對“Kensington Pride”芒果[17]和Keitt芒果[24]的研究結(jié)果相一致。

圖1 貯藏期間芒果果實硬度的變化Fig.1 Changes in firmness of mango fruit during storage注:“*”和“**”分別表示同一時間點不同處理間存在 顯著差異(p<0.05)和極顯著差異(p<0.01);圖2～圖7同。

2.2 SNP對芒果果實果膠含量的影響

果膠是構(gòu)成細胞壁和胞間層的主要成分,采后果實中原果膠會在相關(guān)酶的作用下發(fā)生水解,導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)溶解,細胞間粘合力下降,果實軟化[25]。由圖2A可以看出,隨著芒果貯藏時間的延長,對照和SNP處理果實中可溶性果膠的含量均呈增加趨勢。與對照相比,SNP處理果實中可溶性果膠的增加較少,至貯藏第20 d時,SNP處理中可溶性果膠含量僅為對照的83.8%,差異達到顯著水平(p<0.05)。與可溶性果膠含量的變化趨勢相反,貯藏期間,對照和SNP處理果實中原果膠的含量均逐漸降低(圖2B)。然而,SNP處理明顯降低了原果膠的水解程度,在貯藏第20 d時,SNP處理中原果膠含量為對照的1.8倍,極顯著高于對照(p<0.01)。相關(guān)性分析表明:果實硬度與原果膠含量具有極顯著的正相關(guān)性(r=0.989,p<0.01),而與可溶性果膠含量呈極顯著負相關(guān)(r=-0.959,p<0.01)(表1)。由此可見,果實軟化與果膠物質(zhì)的降解極顯著相關(guān)(p<0.01)。SNP通過抑制果實中原果膠的降解,減少可溶性果膠的增加,維持了細胞壁結(jié)構(gòu)的完整性,從而這有助于延緩果實軟化進程。SNP對芒果果實細胞壁果膠物質(zhì)的作用效果與NO在肥城桃[13]和鴨梨[15]上的效果相一致。

圖2 貯藏期間芒果果實可溶性果膠含量(A) 和原果膠含量(B)的變化Fig.2 Changes in soluble pectin content(A) and propectin content(B)of mango fruit during storage

2.3 SNP對芒果果實纖維素含量的影響

纖維素參與構(gòu)成植物細胞壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),對細胞起著骨架支持和保護作用,在果實成熟過程中,纖維素會發(fā)生降解,從而導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)的解體和果實的軟化。圖3結(jié)果表明,隨著芒果采后貯藏時間的延長,果實中纖維素含量逐漸降低,這與Yashoda等[26]和Chourasia等[2]在芒果上的研究結(jié)果相一致。當芒果貯藏至第20 d時,對照果實中纖維素含量僅為貯藏前的36.4%。然而,SNP處理顯著減輕了果實中纖維素的損失,此時,SNP處理中纖維素含量為貯藏前的57.4%,為對照的1.6倍,極顯著高于對照(p<0.01)。相關(guān)性分析結(jié)果表明:纖維素含量與果實硬度、原果膠含量均呈極顯著正相關(guān)(r=0.925,p<0.01;r=0.922,p<0.01)(表1),而與可溶性果膠含量呈極顯著負相關(guān)性(r=-0.817,p<0.01)。趙云峰等[27]認為,纖維素降解會導(dǎo)致構(gòu)成細胞壁纖維素微纖絲-半纖維素交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松弛,果膠物質(zhì)外露,這將有利于細胞壁水解酶攻擊底物,從而促進了細胞壁組分的解聚。本研究結(jié)果表明,SNP處理能夠有效減緩芒果貯藏期間纖維素降解,從而保護果膠物質(zhì)免受水解酶的作用,從而減少了原果膠的降解和可溶性果膠的增加,維持果實正常的細胞壁結(jié)構(gòu),延緩了果實軟化進程。這與朱樹華等[13]在肥城桃和高維亞等[28]在蓮霧果上的研究結(jié)論相一致。

圖3 貯藏期間芒果果實纖維素含量的變化Fig.3 Changes in cellulose content of mango fruit during storage

2.4 SNP對芒果果實PG和PME活性的影響

PG是果實成熟軟化的關(guān)鍵酶之一,主要作用是將果實細胞壁果膠糖中多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖醛酸,使細胞壁中膠層解體,導(dǎo)致果實軟化[29]。由圖4A可以看出,隨著芒果貯藏時間的延長,對照和SNP處理果實中PG活性整體表現(xiàn)為增加的趨勢。然而,SNP處理能明顯推遲PG活性的升高,顯著降低PG活性(p<0.05)。在整個貯藏期間,SNP處理果實中PG活性平均為對照的85.9%。相關(guān)性分析表明,PG活性與硬度、原果膠和纖維素含量均呈極顯著負相關(guān)(r=-0.870,p<0.01;r=-0.844,p<0.01;r=-0.919,p<0.01),但與可溶性果膠含量呈極顯著正相關(guān)(r=0.836,p<0.01),表明PG與芒果果實軟化和細胞壁物質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。SNP處理可以通過調(diào)節(jié)PG活性,延緩貯藏芒果細胞壁的降解,進而降低果實軟化程度。這與Zaharah等[17]在Kensington Pride芒果上的研究結(jié)論相一致。

PME主要作用是水解果膠分子中甲酯化的C6羧基,使之生成多聚半乳糖醛酸和甲醇,增加了果膠在水中的溶解性,是PG作用的必要前提[30]。圖4B表明,貯藏后的5 d內(nèi),對照中PME活性明顯增加,隨后PME活性呈波動式降低。然而,與對照相比,SNP處理顯著抑制了貯藏前期果實中PME活性的升高(p<0.05),在貯藏第5 d時,SNP處理中PME活性僅為對照的84.5%。隨后PME活性緩慢升高,至貯藏第15 d時達到最大值,之后快速降低。進一步分析可知,盡管SNP處理降低了果實貯藏前期(0～5 d)PME活性的增加,但是卻保持了貯藏后期(10～20 d)果實中較高的PME活性。這可能是由于，在貯藏前期SNP處理通過對PME活性的抑制,減少了PG作用底物,從而降低果膠水解,而后期一方面保持較高的PME活性,另一方面抑制PG活性的增加,從而導(dǎo)致水解產(chǎn)物果膠酸積累，并與游離的鈣離子結(jié)合,強化了細胞壁結(jié)構(gòu),因此減緩了果實的軟化[17,31]。Vázquez-Celestino等[31]研究也表明,NO+涂蠟處理在減緩Manila芒果采后軟化過程中保持了較高的PME活性。相關(guān)性分析表明,PME活性與果實硬度具有正相關(guān)性(r=0.484),但未達到顯著水平(表1),說明PME參與果實軟化進程,但可能不是關(guān)鍵酶。Zaharah等[17]研究發(fā)現(xiàn)，NO處理降低貯藏期間“Kensington Pride”芒果果實硬度的損失與其保持果實中較高的PME活性具有明顯的正相關(guān)性。然而在肥城桃[13]、木瓜[16]和日本李[32]的研究中,卻發(fā)現(xiàn)NO對果實硬度的保持與抑制PME活性有關(guān)。這可能與不同果實細胞壁組成和成熟軟化特性之間存在的差異有關(guān)。

圖4 貯藏期間芒果果實中PG活性(A) 和PME活性(B)的變化Fig.4 Changes in PG activity(A)and PME activity(B)of mango fruit during storage

2.5 SNP對芒果果實CX活性的影響

纖維素酶能促進纖維素的降解,在果實軟化和衰老等過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[33]。已有研究表明,隨著芒果果實的成熟軟化,CX活性逐漸增加[2,34]。圖5結(jié)果表明,隨著芒果貯藏時間的延長,對照和SNP處理中果實CX活性均表現(xiàn)為先增加后降低的變化趨勢。對照果實中,CX活性在貯藏前期升高較快,于貯藏第10 d達到最大值,隨后快速降低。而SNP處理極顯著降低了貯藏前期(0～5 d)果實中CX活性的增加(p<0.01),并且推遲CX活性的峰值到貯藏第15 d。相關(guān)性分析表明,CX活性與果實硬度、原果膠和纖維素含量呈顯著負相關(guān)(r=-0.557,p<0.05;r=-0.612,p<0.05;r=-0.534,p<0.05)(表1)。由此可見,SNP處理能夠通過調(diào)節(jié)果實中CX活性的變化,維持細胞壁中纖維素和果膠的結(jié)構(gòu),從而延緩果實的軟化進程。NO對果實CX活性的作用效果也在香蕉[14]、木瓜[16]和“Kensington Pride”芒果[17]的研究中得到證實。朱樹華等[13]認為，在果實中NO會部分地被氧化為亞硝酸,從而降低CX中色氨酸微域的pH,導(dǎo)致一些色氨酸更加暴露;配基結(jié)合改變了色氨酸的微環(huán)境,同時使酶分子構(gòu)象發(fā)生變化,從而引起CX構(gòu)象和生理功能的改變。

表1 果實硬度、細胞壁組分和水解酶活性變化的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between fruit firmness,cell wall components and cell wall enzymes

圖5 貯藏期間芒果果實中CX活性的變化Fig.5 Changes in CX activity of mango fruit during storage

2.6 SNP對芒果果實β-Gal活性的影響

β-Gal是與細胞壁多糖組分降解相關(guān)的重要糖苷酶之一,可通過降解具有支鏈的多聚醛酸,使細胞壁組分變得不穩(wěn)定,從而使果膠降解或溶解[35]。已有研究表明,在芒果成熟期間,果實中的β-Gal活性會明顯升高,并伴隨有果膠的溶解和果實的軟化[34,36-37]。本研究結(jié)果表明,在芒果貯藏期間,對照果實中，β-Gal活性迅速增加,至貯藏第10 d達到最大值,隨后逐漸降低(圖6),這與前人研究結(jié)果相似[34,36-37]。SNP處理中β-Gal活性變化趨勢與對照相似,但是在貯藏前期,β-Gal活性上升速度較為緩慢,在貯藏10 d內(nèi)活性極顯著低于對照(p<0.01),而其活性最大值出現(xiàn)在貯藏第15 d。相關(guān)性分析結(jié)果表明,β-Gal活性變化與硬度、原果膠含量和纖維素含量呈極顯著負相關(guān)(r=-0.962,p<0.01;r=-0.966,p<0.01;r=-0.848,p<0.01),而與可溶性果膠含量呈極顯著正相關(guān)(r=0.937,p<0.01)(表1)。因此,β-Gal可能在芒果軟化和細胞壁成分降解中具有重要的作用。SNP處理對芒果果實中β-Gal活性的影響可以進一步說明果膠溶解性降低(圖2A和2B)和果實硬度提高(圖1)的原因。Liu等[15]研究也發(fā)現(xiàn),NO處理可以明顯抑制鴨梨冷藏期間果實中β-Gal活性,從而維持較高的果實硬度,這與本研究結(jié)果一致。

圖6 貯藏期間芒果果實中β-Gal活性的變化Fig.6 Changes in β-Gal activity of mango fruit during storage

2.7 SNP對芒果果實α-L-Af活性的影響

α-L-Af主要是通過降解植物細胞壁果膠和半纖維素多聚體中阿拉伯糖支鏈,從而破壞細胞壁的完整性,參與調(diào)節(jié)果實的成熟軟化[35,38-39]。已有研究發(fā)現(xiàn),多種果實采后成熟軟化與α-L-Af活性作用具有明顯的相關(guān)性[40-42]。圖7結(jié)果表明,隨著芒果貯藏時間的延長,對照組中α-L-Af活性快速增加,至貯藏第10 d達到最大值,隨后逐漸降低。然而Ali等[23]研究卻發(fā)現(xiàn)，在“Harumanis”芒果成熟軟化過程中，α-L-Af活性并沒有明顯的變化。其原因可能與不同品種的果實中細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)不同有關(guān)[43]。由圖7也可以看出,SNP處理中α-L-Af活性總體表現(xiàn)為增加的趨勢,然而與對照相比,貯藏5～10 d時，SNP處理極顯著降低了貯藏前期果實中α-L-Af活性的增加(p<0.01),并推遲其最大值出現(xiàn)的時間至20 d。相關(guān)性分析結(jié)果表明,α-L-Af活性變化與硬度、原果膠含量均呈極顯著負相關(guān)(r=-0.710,p<0.01,r=-0.759,p<0.01),與纖維素含量呈顯著負相關(guān)(r=-0.632,p<0.05),而與可溶性果膠含量呈顯著正相關(guān)(r=0.636,p<0.05)(表1)。因此,SNP減緩果實軟化與其抑制α-L-Af活性相關(guān)。目前還未見其他有關(guān)NO調(diào)節(jié)果實成熟軟化過程中α-L-Af活性的報道。

圖7 貯藏期間芒果果實中α-L-Af活性的變化Fig.7 Changes in α-L-Af activity of mango fruit during storage

3 討論與結(jié)論

芒果采后極易軟化,而果實硬度的降低與細胞壁原果膠含量和纖維素含量的下降具有極顯著正相關(guān)性(p<0.01),而與可溶性果膠含量的增加極顯著負相關(guān)(p<0.01)。因此,果膠物質(zhì)和纖維素等細胞壁組分的降解可能是采后芒果軟化的重要原因。

芒果軟化過程中有多種細胞壁水解酶的參與。硬度的降低與PG、β-Gal和α-L-Af活性的增加具有極顯著的負相關(guān)性(p<0.01),與CX活性的增加具有顯著的負相關(guān)性(p<0.05),而與PME具有一定的正相關(guān)性,但相關(guān)性不顯著(p>0.05)。表明PG、CX、β-Gal和α-L-Af在果實軟化過程中起重要作用,PME雖然參與果實軟化進程,但可能不是關(guān)鍵酶。

SNP處理明顯降低了貯藏期間“臺農(nóng)”芒果果實中PG、CX、β-Gal和α-L-Af的活性,降低貯藏前期PME活性,而保持貯藏后期較高的PME活性,從而降低了細胞壁中果膠物質(zhì)和纖維素的水解和轉(zhuǎn)化,較好地維持細胞壁結(jié)構(gòu)的完整性,減緩了果實軟化的進程。