異淀粉酶產(chǎn)生菌的分離鑒定 及異淀粉酶基因的克隆表達

趙淑琴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學基礎(chǔ)實驗教學中心,甘肅蘭州 730070)

異淀粉酶(E.C.3.2.1.33,Isoamylase)是一種內(nèi)切型淀粉酶,僅專一性作用于支鏈淀粉分支點的α-1,6-糖苷鍵,使其形成直鏈淀粉,而對直鏈淀粉分子中的α-1,6-糖苷鍵不起作用,這種特性最早在淀粉結(jié)構(gòu)的理論研究中應(yīng)用[1]。到七十年代,異淀粉酶的應(yīng)用越來越廣泛,逐步從實驗室研究向工業(yè)化應(yīng)用發(fā)展,已擴展到淀粉糖漿,啤酒和酒精生產(chǎn)等多個淀粉深加工領(lǐng)域[2]。主要原因是在淀粉加工過程中,異淀粉酶和糖化酶的協(xié)同作用可以加速糖化過程,并提高糖化率,和β-淀粉酶配合使用能極大提高麥芽糖得率[3-4]。由于異淀粉酶可以將最小單位的支鏈分解,最大限度地利用淀粉原料,因此是一種需求量很大的支鏈淀粉酶[5-7]。目前除了較成功地應(yīng)用于高葡萄糖漿,高麥芽糖漿,低聚寡糖和啤酒生產(chǎn),在醫(yī)藥領(lǐng)域亦有應(yīng)用。

自然界中,異淀粉酶來源廣泛。目前已在大米、甜玉米、馬鈴薯、蠶豆等許多植物中發(fā)現(xiàn)有異淀粉酶[8]。高等動物的肝臟、肌肉中也有類似于異淀粉酶水解α-1,6-糖苷鍵的酶存在,但將這些來源的異淀粉酶應(yīng)用于高速發(fā)展的工業(yè)上是遠遠不夠的。微生物來源的異淀粉酶數(shù)量龐大,而且根據(jù)菌的生長特性可以分離出耐高溫、耐低溫、嗜酸性、嗜堿性等適合于不同工業(yè)需求的異淀粉酶,因此近年來,人們越來越多的關(guān)注微生物來源的異淀粉酶。

1940年,日本學者首次從酵母細胞提取液中發(fā)現(xiàn)異淀粉酶[9],但能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的菌種還是比較難得[10]。1993年,王武等[11]對短桿菌異淀粉酶產(chǎn)生菌進行誘變,選育,從初始酶活為7 U/mL的出發(fā)菌,獲得了搖瓶發(fā)酵液中酶活單位最高可達20 U/mL的突變菌株,是至今國內(nèi)較為優(yōu)良的產(chǎn)異淀粉酶菌種,但一直未見其后續(xù)研究及工業(yè)化生產(chǎn)的相關(guān)報道。2003年,王弋等[12]誘變中溫地衣芽孢桿菌,其出發(fā)菌株的異淀粉酶活性達到3.35 U/mL,誘變后酶活提高到7.37 U/mL。2005年,夏靜等[13]從云南梁河溫泉水樣中分離篩選到1株產(chǎn)異淀粉酶的棲熱菌(Thermus),其產(chǎn)酶的初始酶活達4.14 U/mL。關(guān)于如何獲得高產(chǎn)量、高穩(wěn)定性微生物來源的異淀粉酶方面的報道在國內(nèi)并不多見[7]。2016年,冉紅艷[14]將嗜熱放線菌的異淀粉酶基因克隆到大腸桿菌里,獲得成功表達,酶活力是18.8 U/mL。國外,1988年,Amemura[15]首先使用鳥槍克隆法克隆并測序了P.amyloderamosa的異淀粉酶編碼基因。1989年,Togoni等[16]完成了來源于一株假單胞菌的異淀粉酶編碼基因的克隆和測序。1999年,Abe J[17]將FlavobacteriumodoratumKU異淀粉酶基因成功表達在大腸桿菌中,酶活力達到85.9 U/mL。2007年,Cho等[18]克隆并鑒定了來自Pectobacteriumcarotovrum亞種carotovorum(Pcc)LY34的異淀粉酶基因,并將其表達在大腸桿菌DH5α中,酶活力為35.5 U/mL。因此,細菌異淀粉酶普遍分泌量較低,常規(guī)方法如優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件、紫外誘變等無法從根本上提高酶活,細菌異淀粉酶基因重組表達是解決這一難題的主要策略之一[19]。本實驗從富含淀粉的土壤中分離篩選目的菌株,通過克隆其異淀粉酶基因,以大腸桿菌為受體細胞,旨在建立細菌異淀粉酶基因的克隆與表達系統(tǒng),獲得高產(chǎn)量、高穩(wěn)定性的異淀粉酶,彌補工業(yè)上的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 學校周邊、奶牛場及校內(nèi)食堂垃圾附近富含淀粉的土壤;支鏈淀粉 玉米來源,金品化學技術(shù)有限公司;TIANamp Bacteria DNA Kit 天根生化科技有限公司;Plus DNA Clean/Extraction Kit 北京艾比根生物技術(shù)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Primer star MAX、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA A-Tailing Kit、I型核酸染料Gold View、BamH I和Hind III限制性核酸內(nèi)切酶 均購于索萊寶生物公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

TG1850-WS高速臺式低溫離心機 盧湘儀離心機儀器有限公司;JY-E型電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-系列超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ZHWY-100B多振幅軌道搖床 鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司;BWS-系列恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司;WFH-203紫外檢測儀 上海青浦滬西儀器廠;ZF-1臺式三用紫外檢測儀 上虞市華宏凈化設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 平板分離培養(yǎng)基[20]:支鏈淀粉5.00 g,NaCl 2.52 g,瓊脂粉7.5 g,蛋白胨5.00 g,蒸餾水500 mL,pH自然,121.0 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:支鏈淀粉5.00 g,KH2PO40.61 g,CaCl20.04 g,(NH4)2SO40.50 g,蛋白胨1.00 g,蒸餾水200 mL,pH自然,121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 樣品的采集 在蘭州周邊奶牛場、校內(nèi)食堂垃圾附近、下水道、糕點店、面粉廠等地將富含淀粉的土壤刮取20 g,裝入自封袋,并標記時間和地點。

1.2.3 菌株的篩選 平板初篩[21]:稱取10 g樣品,放入錐形瓶中,倒入100 mL無菌水[13],放入恒溫搖床中37 ℃,120 r/min,培養(yǎng)24 h后,用移液槍吸取1 mL并稀釋100倍,從稀釋液中吸取50 μL均勻涂布于平板分離培養(yǎng)基上,置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),37 ℃培養(yǎng)24 h后,挑選有透明圈、圈徑比較大的菌落并標記備用[14-15]。

平板復(fù)篩:根據(jù)初篩平板上菌落的形狀大小、顏色及是否產(chǎn)淀粉酶的特性,將初篩后的各種菌種分別接種在平板上,于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h。挑選透明圈較大的單菌落進行搖瓶復(fù)篩。

搖瓶復(fù)篩:從復(fù)篩平板上挑取單菌落,進行搖瓶復(fù)篩,將120 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶中,在恒溫搖床內(nèi)37 ℃、120 r/min培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液于8000 r/min,離心10 min后,取上清液測定酶活。

1.2.4 酶活力的測定 淀粉酶酶活力的測定[21]:采用3,5-二硝基水楊酸法測定酶活力(以麥芽糖做標準曲線),測定實驗菌株在OD520 nm的光密度值。酶活力單位定義:在40 ℃、pH6.0條件下,每分鐘從1%的支鏈淀粉中釋放出1 mmol麥芽糖的酶量定義為1個酶活力單位(U)

式中:K為標準曲線斜率;F為樣品溶液反應(yīng)前的總量,100 mL;S為樣品測試量,S=0.5;T為時間,T=10 min;A為實驗組吸光度;A0為對照組吸光度。

取15 mL具塞試管8支,編號,分別加入粗酶液和1%的支鏈淀粉溶液各0.5 mL,以蒸餾水代替粗酶液的試管做對照。再加入3,5-二硝基水楊酸1.5 mL,搖勻,沸水浴5 min,取出冷卻,用蒸餾水稀釋至10 mL,搖勻后用分光光度計于520 nm波長下比色,記錄吸光值,根據(jù)標準曲線進行結(jié)果計算,每個樣平行做3份,求平均值。

1.2.5 菌種的鑒定 形態(tài)學及生理生化鑒定:通過平板培養(yǎng)和穿刺接種法培養(yǎng)篩選出的菌株,觀察其菌落形態(tài)和運動能力,再挑取平板培養(yǎng)的單個菌落,通過革蘭氏染色將其分為革蘭氏陽性菌G+和革蘭氏陰性菌G-;通過孔雀綠芽孢染色后,觀察該菌是否產(chǎn)生芽孢。

菌株主要生理生化研究:篩選出劃線培養(yǎng)24 h后的菌種,然后挑取單菌落,進行細菌的硝酸鹽還原試驗、甲基紅試驗、接觸酶試驗(過氧化氫酶試驗)、檸檬酸鹽試驗、硫化氫試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、氧化酶試驗、精氨酸水解試驗[22]。

分子生物學鑒定:16S rDNA序列分析[23]:將提取的菌株總DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,用16S rDNA通用引物進行PCR擴增。細菌專一性16S rDNA引物由TaKaRa公司合成,其序列為:正向引物(27f):5′-AGTTTGATCCTGGTCAG-3′,反向引物(1492r):5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′;16S rDNA PCR反應(yīng)體系正向引物2 μL,反向引物2 μL,模板DNA4 μL,Primer star MAX 25 μL,ddH2O 17 μL。擴增過程為:94 ℃,5 min;94 ℃,30 s;55～65 ℃,30 s;72 ℃,2 min;共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物4 ℃保存。取擴增產(chǎn)物2 μL,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件為:電壓110 V,電泳30～45 min。用上海生工的膠回收試劑盒進行16S rDNA PCR產(chǎn)物純化。經(jīng)純化后,送與北京天一輝遠公司完成測序。然后在NCBI中進行BIAST同源性比對,分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

gyrB基因序列擴增鑒定:湯際亮等[23]報道,單獨分析16S rDNA序列無法區(qū)分解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌這樣親緣關(guān)系很近的菌種。因此,采用gyrB序列分析法進一步鑒定。gyrB基因通用引物序列:上游引物:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGC AYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′,下游引物:5′-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCR TCNGTCAT-3′;其中Y、N、R表示兼并堿基,Y表示C或T,N表示A、T、C或G,R表示A或G。

PCR反應(yīng)條件:96 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35個循環(huán);72 ℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收,并送與北京天一輝遠公司進行測序,然后在NCBI中進行BLAST的序列同源性比對進一步分析鑒定。

1.2.6 異淀粉酶基因的克隆

1.2.6.1 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI上的遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)異淀粉酶基因編碼區(qū)序列(gb:KC133281.1),使用Oligo 6.57和Primer 5.0設(shè)計PCR擴增引物,送至金博研生物科技有限公司進行合成,兩條引物的序列分別為:

LEFT:5′-GATGATGGCAGTTACGGCAG-3′;RIGHT:5′-CATGTCACTAGCTTGTCCGC-3′

1.2.6.2 異淀粉酶基因PCR擴增 菌株LZ-5基因組的提取,按照TIANamp Bacteria DNA Kit說明書提取,擴增反應(yīng)體系如下:LEFT引物2 μL,RIGHT引物2 μL,模板DNA 4 μL,Primer star MAX 25 μL,ddH2O 17 μL。

擴增條件:熱變性為94 ℃,30 s;退火溫度為62 ℃,30 s;延伸溫度為72 ℃,2 min;循環(huán)次數(shù)為30個;最后一個循環(huán)溫度為72 ℃,10 min。擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.6.3 擴增產(chǎn)物3′末端加A尾 按照Plus DNA Clean/Extraction Kit說明書進行擴增產(chǎn)物膠回收,回收產(chǎn)物利用DNA A-Tailing Kit對淀粉酶基因擴增產(chǎn)物進行3′末端加A尾。反應(yīng)體系為10×A-Tailing Buffer 5 μL,dNTP Mixture 4 μL,A-Tailing Enzyme 1 μL,異淀粉酶基因擴增產(chǎn)物10 μL,ddH2O 30 μL。反應(yīng)條件為72 ℃水浴槽中反應(yīng)20 min,然后靜置冰中2 min,最后4 ℃保存。

1.2.6.4 異淀粉酶基因與載體的A-T連接 將3′末端加了A尾的異淀粉酶基因的擴增片段與pMD-18T載體(3′添加了T尾)連接。反應(yīng)體系為Solution I 6 μL,pMD-18T載體1 μL,異淀粉酶基因擴增產(chǎn)物5 μL,ddH2O 8 μL。將體系中溶液混合后,17 ℃連接16 h,獲得重組質(zhì)粒pMD-18T-iam1。

1.2.6.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5a 取出儲存在-80 ℃冰箱的大腸桿菌E.coliDH5a感受態(tài)細胞,放置冰中融化,再加入10 μL重組質(zhì)粒,輕彈管壁使其混合均勻,置于冰中30 min,然后在42 ℃水浴槽中反應(yīng)2 min,再置于冰中2 min。在離心管中加入1 mL LB液體培養(yǎng)基(不加氨芐青霉素),37 ℃搖床培養(yǎng)1 h后,5000 r/min離心1 min,棄去部分上清液,保留約100 μL上清液再次懸浮細胞,然后將其用涂布棒涂抹在含X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB平板上,放入培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12～16 h,形成具有藍色和白色的單個菌落。挑選白色菌落即原核工程菌,置于LB液體培養(yǎng)基,37 ℃,180 r/min搖床培養(yǎng)12～16 h[24]。

1.2.6.6 重組質(zhì)粒的提取及酶切鑒定 提取的重組質(zhì)粒用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切。反應(yīng)體系為10×Loading Buffer 3 mL,BamH Ⅰ 1 μL,Hind Ⅲ 1 μL,重組質(zhì)粒pMD-18T-iam1 4 μL。然后往體系中加ddH2O至20 μL混勻后,放入37 ℃水浴槽中反應(yīng)3 h。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后將檢測符合異淀粉酶基因的片段送至金博研生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.7 異淀粉酶基因在大腸桿菌中的表達 由于原核工程菌所產(chǎn)生的異淀粉酶是包涵體,所以將原核工程菌用1.0 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)4 h后,用細胞破碎儀對工程菌進行破碎,以未插入重組質(zhì)粒的大腸桿菌為對照,按照1.2.4酶活力的測定方法測工程菌的異淀粉酶活力[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學觀察及生理生化鑒定

采用碘熏法在平板上對異淀粉酶產(chǎn)生菌進行篩選，選出1株產(chǎn)異淀粉酶的菌株LZ-5，結(jié)果如圖1所示,測定其酶活力值為10.9 U/mL。通過平板培養(yǎng)后觀察菌株LZ-5為紅色菌落,菌落不透明,有形狀似小傘的皺褶,由中央凸起向周圍擴散,邊緣不整齊;芽孢可見,兩端鈍圓,直徑約0.5 μm,長約2.0 μm。用孔雀綠芽孢染色后,能清晰看到芽孢,結(jié)果見圖2。對菌株LZ-5進行生理生化鑒定,實驗結(jié)果(表1)表明,菌株LZ-5可發(fā)酵多種糖,產(chǎn)酸產(chǎn)氣,能液化明膠,吲哚試驗和檸檬酸鹽試驗為陰性,其他試驗均為陽性。結(jié)合形態(tài)學觀察,初步推斷該菌屬于芽孢桿菌科。與文獻報道[23]解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的生理生化特性非常相近。

圖1 菌株LZ-5的水解圈(A)及菌落形態(tài)(B)Fig.1 The transparent circle of strain LZ-5 after iodine staining(A)and the colonial morphology(B)

圖2 菌株LZ-5革蘭氏染色形態(tài)(A) 及孔雀綠芽孢染色形態(tài)(B)(10×100)Fig.2 Morphology of strain LZ-5 after gram staining(A) and after malachite green spore staining(B)(10×100)

表1 菌株 LZ-5的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain LZ-5

2.2 分子生物學鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株LZ-5的16S rDNA序列分析 菌株LZ-5經(jīng)16S rDNA通用引物PCR擴增后,用瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖3所示,將電泳后的條帶進行膠回收后進行PCR擴增,再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。將PCR擴增后的產(chǎn)物送與北京天一輝遠公司進行測序,根據(jù)測得的序列在NCBI中進行BLAST比對,LZ-5菌株與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)等的16S rDNA都具有高度相似性,相似度都為99%,序列比對(圖4)分析它們都處于同一分支,所以通過16S rDNA不能確定該菌。

圖3 LZ-5菌的16S rDNA序列PCR擴增結(jié)果 Fig.3 PCR amplification results of 16s rDNA sequence of strain LZ-5

圖4 菌株LZ-5的16S rDNA序列比對Fig.4 The 16S rDNA sequence alignment of strain LZ-5

2.2.2 菌株的gyrB基因序列分析 菌株 LZ-5經(jīng)gyrB基因序列擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳,將電泳后的產(chǎn)物進行膠回收,并送與北京天一輝遠公司進行測序,測序的結(jié)果:

在NCBI中進行BLAST序列比對分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與枯草芽孢桿菌的gyrB基因具有99%的同源性，因此鑒定菌株LZ-5為枯草芽孢桿菌。

2.3 異淀粉酶基因的PCR擴增

以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板,LEFT和RIGHT為引物,退火溫度為62 ℃,進行擴增。擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖5可知,擴增出的異淀粉酶基因片段大小約2000 bp。

圖5 異淀粉酶基因的PCR擴增Fig.5 PCR amplification of isoamylase gene注： M:DNA Marker;1:異淀粉酶基因。

2.4 重組質(zhì)粒的篩選

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌E.coliDH5a感受態(tài)細胞,然后37 ℃搖床培養(yǎng)1 h,留約100 μL上清液重新懸浮細胞并涂抹在含X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB平板上,經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h后,形成具有藍色和白色的單個菌落。由圖6可知,重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入了大腸桿菌。

圖6 藍白斑篩選Fig.6 White-blue plaque selection

2.5 重組質(zhì)粒鑒定

挑選白色菌落,置于LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素),培養(yǎng)12～16 h,然后將提取的重組質(zhì)粒進行酶切,酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖7可知,酶切下來的基因片段大小為2000 bp,與圖5中PCR擴增出的異淀粉酶基因大小接近。重組質(zhì)粒的酶切小片段回收后,送至金唯智生物技術(shù)有限公司進行測序。測序結(jié)果表明:異淀粉酶基因全長1980 bp,通過軟件MEGA5.1上的Clustal W與NCBI上報道的遲緩芽孢桿菌異淀粉酶基因進行比對,相似度為96%,表明已成功克隆出了異淀粉酶基因。

圖7 質(zhì)粒pMD-18T-iam1載體酶切鑒定的電泳結(jié)果Fig.7 Restriction fragment analysis of vector pMD-18T-iam1注：M:DNA Marker；1:環(huán)狀質(zhì)粒；2:線性質(zhì)粒； 3:重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；4:異淀粉酶基因。

2.6 原核工程菌產(chǎn)異淀粉酶的酶活性

將原核工程菌用1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后,用細胞破碎儀對工程菌進行破碎,以未插入重組質(zhì)粒的大腸桿菌為對照,按照1.2.4的異淀粉酶酶活力測定方法,測得異淀粉酶酶活力為28.4 U/mL,是原菌的2.6倍。

3 結(jié)論

本實驗從富含淀粉的土壤中篩選出1株高產(chǎn)異淀粉酶的菌株LZ-5,通過菌落形態(tài)觀察、生理生化特性實驗、16S rDNA序列及gyrB基因分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹對其進行鑒定,結(jié)果表明菌株LZ-5為枯草芽胞桿菌,根據(jù)NCBI上的遲緩芽孢桿菌異淀粉酶基因設(shè)計引物,通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)獲得該菌株的異淀粉酶基因的序列,構(gòu)建pMD-18T-iam1載體,導(dǎo)入到E.coliDH5a感受態(tài)細胞,經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達,構(gòu)建的大腸桿菌工程菌,通過細胞破碎儀破碎后,測得異淀粉酶酶活力為28.4 U/mL,是菌株LZ-5的2.6倍。在本研究基礎(chǔ)上,下一步探索把該異淀粉酶基因采用合適的載體導(dǎo)入出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌中,實現(xiàn)同源表達,利用該菌株天然的、優(yōu)良的分泌表達系統(tǒng),實現(xiàn)突變異淀粉酶基因更高效的表達。