羧甲基化改性制備 高保水、軟凝膠型卡拉膠

劉曉婷,安鳳平,王藝偉,黃 群,滕 慧,宋洪波

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

卡拉膠是提取自紅藻的水溶性膠體,其中κ-卡拉膠是目前應(yīng)用最為廣泛的一種卡拉膠,具有獨(dú)特的熱可逆凝膠性質(zhì)和抗蛋白凝結(jié)性等特點(diǎn)[1-2],在食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、包裝行業(yè)、制藥等領(lǐng)域已經(jīng)廣泛應(yīng)用[3-4]。

傳統(tǒng)方法加工的κ-卡拉膠,特別是高強(qiáng)度卡拉膠在實(shí)際應(yīng)用中膠體易收縮,具有泌水性、保水性能差的缺點(diǎn),其應(yīng)用受到限制。近年來、高保水、軟凝膠等特種膠體的市場需求量越來越大,其中高保水、軟凝膠兼?zhèn)涞哪z體因具有更好的持水穩(wěn)定性及柔和的凝膠特性,可賦予產(chǎn)品穩(wěn)定的組織形態(tài)及軟彈性特征,因此在乳制品、飲料、肉制品等食品加工領(lǐng)域以及精細(xì)化工、生物醫(yī)藥中有良好的應(yīng)用前景[5-7]。目前,軟凝膠的研究主要集中在ι-卡拉膠[6-7];有研究表明,制備κ-卡拉膠過程中,在煮膠工序加入膠聯(lián)系劑以改善膠體的保水性[8]。通常,根據(jù)市場需求的軟凝膠膠體的凝膠強(qiáng)度應(yīng)小于300 g/cm2,高保水膠體的析水率不大于0.5%,優(yōu)質(zhì)軟凝膠膠體應(yīng)具備較低的凝膠強(qiáng)度和小的析水率。目前關(guān)于以κ-卡拉膠為原料,改性制備高保水、軟凝膠型卡拉膠的研究尚未見報(bào)道。

本文研究羧甲基化反應(yīng)改性κ-卡拉膠,使卡拉膠中的羥基被羧甲基取代,以低析水率為主要目標(biāo),同時(shí)兼顧較低的凝膠強(qiáng)度,對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化;運(yùn)用紅外光譜掃描、核磁共振探討改性機(jī)理,為高保水、軟凝膠型卡拉膠的加工提供理論和方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

κ-卡拉膠 福建綠新食品有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鉀、醋酸 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氯乙酸 分析純,天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司。

DS32-ⅢB型雙螺桿擠壓機(jī) 濟(jì)南賽信機(jī)械有限公司;HH-6型恒溫水浴鍋 金壇市雙捷試驗(yàn)儀器廠;101-0型鼓風(fēng)干燥機(jī) 上海陽光試驗(yàn)儀器有限公司;FZl02型微型植物粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;NG1型指針型凝膠強(qiáng)度測定儀 中國科學(xué)院海洋研究所;BS124S型電子分析天平、TE612-L型電子天平、PB-10pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;FTIR-8400S型傅立葉變換紅外光譜儀 日本島津公司;ADVANCE III HD 400M型核磁共振儀 瑞士布魯克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 改性卡拉膠的制備 采用螺桿擠壓機(jī)預(yù)處理κ-卡拉膠粉,螺桿擠壓處理工藝條件為:水料比2.0∶5 mL/g、溫度75 ℃、螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min;40 ℃恒溫干燥24 h,粉碎后過80目篩,得預(yù)處理卡拉膠粉。

取10.00 g預(yù)處理卡拉膠粉,加入100 mL一定濃度的乙醇溶液并攪拌使卡拉膠均勻分散,分別加入4 mL濃度為20%(w/w)氫氧化鈉溶液至反應(yīng)體系中，使氫氧化鈉濃度為0.8%,于35 ℃水浴保溫1 h;滴加一定量的氯乙酸鈉溶液(由氯乙酸與等摩爾比的20%氫氧化鈉水溶液中和制備得到),按一定的溫度反應(yīng)3 h后,冷卻至室溫;用1 mol/L醋酸調(diào)節(jié)pH至7.0,抽濾后用相應(yīng)濃度的乙醇溶液洗滌濾餅3次,收集濾餅,40 ℃恒溫干燥24 h,粉碎過80目篩得改性卡拉膠粉末[8]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 氯乙酸鈉添加量對改性效果的影響 固定羧甲基化反應(yīng)溫度45 ℃、乙醇濃度60%,按照氯乙酸鈉添加量分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mol進(jìn)行實(shí)驗(yàn),考察氯乙酸鈉添加量對卡拉膠析水率和凝膠強(qiáng)度的影響。

1.2.2.2 羧甲基化反應(yīng)溫度對改性效果的影響 固定氯乙酸鈉添加量0.01 mol、乙醇濃度60%,反應(yīng)溫度分別為40、45、50、55、60、65 ℃,考察羧甲基化反應(yīng)溫度對卡拉膠析水率和凝膠強(qiáng)度的影響。

1.2.2.3 乙醇濃度對改性效果的影響 固定氯乙酸鈉添加量0.01 mol、羧甲基化反應(yīng)溫度45 ℃,考察乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%對卡拉膠析水率和凝膠強(qiáng)度的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以析水率為主要考察指標(biāo)、凝膠強(qiáng)度為輔助考察指標(biāo),選取氯乙酸鈉添加量(A)、羧甲基化反應(yīng)溫度(B)、乙醇濃度(C)3個(gè)因素為自變量,析水率(Y1)、凝膠強(qiáng)度(Y2)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiment

1.2.4 析水率及凝膠強(qiáng)度的測定 將3.00 g改性卡拉膠粉末加入到250 mL燒杯中,量取4 mL 10% KCl溶液,混合均勻,再添加200 mL蒸餾水,95 ℃水浴加熱1.5 h,分成三份裝在30 mL塑料量杯中,蓋上蓋子,待冷卻后于恒溫箱中放置14 h,對制備得到的改性卡拉膠凝膠測定析水率及凝膠強(qiáng)度,平行3次取平均值[4,9-10]。

析水率的測定:精確稱取1.2.4中得到的一定質(zhì)量卡拉膠凝膠,用濾紙吸干凝膠表面水珠后再次進(jìn)行精確稱重,析水率按公式(1)計(jì)算:

K(%)=[(m1-m2)/m1]×100

式(1)

式中:K:試樣的析水率(1.5%改性卡拉膠溶液的凝膠,20 ℃),%;m1:初始凝膠質(zhì)量,g;m2:除去表面水珠后的凝膠質(zhì)量,g。

凝膠強(qiáng)度的測定:將1.2.4中制得的改性卡拉膠凝膠樣品置于凝膠強(qiáng)度測定儀的試樣座上,首先記錄表盤的初始數(shù)值,打開開關(guān),記錄凝膠瞬間破裂時(shí)表盤的數(shù)值,兩個(gè)數(shù)值之差即為凝膠強(qiáng)度[4]。凝膠強(qiáng)度計(jì)算如式(2):

P=G×f

式(2)

式中:P:試樣的凝膠強(qiáng)度(1.5%溶液的凝膠,20 ℃),g/cm2;G:測定的凝膠強(qiáng)度值,g/cm2;f:溫度校正系數(shù),根據(jù)GB 1975-2010,30 ℃環(huán)境下的溫度校正系數(shù)為1.35。

1.2.5 紅外光譜 將干燥的卡拉膠樣品與溴化鉀按照1∶100～1∶150比例混合,充分研磨后,倒入儀器的模具中抽真空壓片,于12 MPa保持30 s,直到壓片呈現(xiàn)透明。傅立葉變換紅外光譜掃描儀掃描范圍為4500～500 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)16～32[11]。

1.2.6 核磁共振 將干燥的卡拉膠充分研磨后裝入樣品管中,采用Brucker DPX-400M型固體核磁共振儀對樣品進(jìn)行13C-NMR譜測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design-Expert V8.0.6及DPS 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用Microsoft Excel 2007及Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性工藝條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 氯乙酸鈉添加量對改性效果的影響 由圖1可知,在氯乙酸鈉添加量為0.005～0.030 mol范圍內(nèi),隨著氯乙酸鈉添加量的增多,改性卡拉膠的析水率和凝膠強(qiáng)度均持續(xù)減小。這是因?yàn)?隨著氯乙酸鈉添加量增多,羧甲基化卡拉膠生成量亦隨之增多,因此析水率及凝膠強(qiáng)度均隨之降低?？紤]到氯乙酸添加量對析水率和凝膠強(qiáng)度具有明顯影響,因此確定氯乙酸鈉添加量0.020～0.030 mol作為優(yōu)化試驗(yàn)的范圍。

圖1 氯乙酸鈉添加量對析水率和凝膠強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of sodium chloroacetate addition on separating water rate and gel strength注:圖中字母不同表示組間差異顯著(p<0.05),下同。

2.1.1.2 羧甲基化反應(yīng)溫度對改性效果的影響 由圖2可知,隨著羧甲基化反應(yīng)溫度的升高,改性卡拉膠的析水率和凝膠強(qiáng)度逐漸減小。是因?yàn)榉磻?yīng)溫度的升高有利于增大氯乙酸鈉向膠體內(nèi)部擴(kuò)散的速率,從而加快羧甲基化反應(yīng)速率[12];綜合考慮,確定羧甲基化反應(yīng)溫度55～65 ℃為優(yōu)化試驗(yàn)范圍。

圖2 羧甲基化反應(yīng)溫度對析水率和凝膠強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of carboxymethylation temperature on separating water rate and gel strength

2.1.1.3 乙醇濃度對改性效果的影響 由圖3可知,隨著乙醇濃度的增加,改性卡拉膠的析水率和凝膠強(qiáng)度均隨之顯著減小(p<0.05);至80%以后,析水率減小的趨勢有所變緩。由于乙醇具備較大極性,對羧甲基化反應(yīng)進(jìn)行起到一定的促進(jìn)作用[13],因此增大乙醇濃度,產(chǎn)物的析水率和凝膠強(qiáng)度均會(huì)減小;此外,由于H2O分子對卡拉膠具有溶脹作用,有助于將反應(yīng)物小分子輸送到卡拉膠內(nèi)部,促使反應(yīng)進(jìn)行,因而適量的水分是必須的。確定乙醇濃度60%～80%為優(yōu)化的參數(shù)范圍。

圖3 乙醇濃度對析水率和凝膠強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on separating water rate and gel strength

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.2.1 響應(yīng)模型建立與分析 對表2中析水率(Y1)與氯乙酸鈉添加量(A)、羧甲基化反應(yīng)溫度(B)、乙醇濃度(C)的關(guān)系進(jìn)行擬合,并根據(jù)表3的方差分析結(jié)果,剔除不顯著項(xiàng)后得到二次多元回歸方程:

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results for response surface experiment

表3 析水率方差分析表Table 3 Variance analysis for separating water rate

Y1=0.25-0.024A-0.026B-0.18C+0.025AC+0.021BC-0.023A2-0.016B2-0.047C2

式(3)

由表3可知,對于析水率模型p<0.0001,模型極顯著;而失擬項(xiàng)p=0.3251>0.05,不顯著,表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,析水率模型的穩(wěn)定性好。氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應(yīng)溫度和乙醇濃度的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對析水率的影響均極顯著(p<0.01);氯乙酸鈉添加量和乙醇濃度的交互作用、羧甲基化反應(yīng)溫度和乙醇濃度的交互作用均極顯著(p<0.01)。

同理,依據(jù)表2中凝膠強(qiáng)度以及表4中的顯著性分析結(jié)果,可得凝膠強(qiáng)度與氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應(yīng)溫度、乙醇濃度關(guān)系的二次多元回歸方程為:

表4 凝膠強(qiáng)度方差分析表Table 4 Variance analysis for gel strength

Y2=263.74-22.02A-27.89B-225.77C+10.39AB+15.58AC+14.92BC-13.04A2-14.40B2+20.80C2

式(4)

由表4可知,凝膠強(qiáng)度模型的顯著性檢驗(yàn)p<0.0001,而失擬項(xiàng)p=0.1028>0.05,說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且穩(wěn)定性好。氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應(yīng)溫度、乙醇濃度3個(gè)因素的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及兩兩因素間的交互作用均極顯著(p<0.01)。

由F值的大小可知,對析水率和凝膠強(qiáng)度影響的主次順序均為:C>B>A,即乙醇濃度>羧甲基化反應(yīng)溫度>氯乙酸鈉添加量。

2.1.2.2 響應(yīng)面分析 由圖4可以看出,氯乙酸鈉添加量和羧甲基化反應(yīng)溫度交互作用對析水率的影響不顯著;氯乙酸鈉添加量和乙醇濃度、以及羧甲基化反應(yīng)溫度和乙醇濃度的交互作用對析水率的影響顯著。此結(jié)果與表3的顯著性分析結(jié)果一致。

圖4 兩因素交互作用對析水率的影響Fig.4 Effects of cross-interaction of two factors on separating water rate

由圖5可知,氯乙酸鈉添加量和羧甲基化反應(yīng)溫度、氯乙酸鈉添加量和乙醇濃度、以及羧甲基化反應(yīng)溫度和乙醇濃度交互作用對凝膠強(qiáng)度的影響均極顯著,與表4的顯著性分析結(jié)果一致。

圖5 兩因素交互作用對凝膠強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of cross-interaction of two factors on gel strength

2.1.2.3 最佳工藝條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 由于改性卡拉膠的析水率越小,其凝膠強(qiáng)度亦越低,因此改性卡拉膠析水率并非越小越好。在保證析水率足夠低的同時(shí),還應(yīng)具備一定的凝膠強(qiáng)度(≤300 g/cm2),滿足軟凝膠的特性。以低析水率為主、凝膠強(qiáng)度為輔,因此運(yùn)用式(3)所示三個(gè)因素與析水率關(guān)系模型,以析水率為0.15%,兼顧較低的凝膠強(qiáng)度,確定的工藝參數(shù)為:氯乙酸鈉添加量0.02 mol、羧甲基化反應(yīng)溫度65.13 ℃、乙醇濃度69.35%?？紤]到實(shí)驗(yàn)可操作性，修正最佳條件為：氯乙酸添加量為0.02 mol、羧甲基化反應(yīng)溫度65 ℃、乙醇濃度69%，在此條件下,制備卡拉膠的析水率為0.16±0.001%、凝膠強(qiáng)度為(205±1.22) g/cm2,與模型(3)和(4)預(yù)測值0.158%、208 g/cm2的相對誤差在1.5%以內(nèi)。

經(jīng)測定,未改性卡拉膠的析水率為4.60%±0.005%、凝膠強(qiáng)度為(2120±10.23) g/cm2。因此,改性卡拉膠的綜合性能得到極大改善,總體表現(xiàn)出優(yōu)秀的保水性能和軟凝膠性能。

2.2 結(jié)果分析

2.2.1 紅外光譜分析 圖6為未改性κ-卡拉膠(KC)、改性卡拉膠(HRKC)的紅外圖譜,對于未改性κ-卡拉膠的紅外圖譜,其中3420 cm-1處吸收峰為-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰,2962 cm-1和2925 cm-1處吸收峰分別為甲基和亞甲基C-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰,1624 cm-1為糖的水化物的吸收峰,1260 cm-1表示硫酸基上O=S=O的伸縮振動(dòng)峰,1159 cm-1處則為醚橋鍵的C-O-C特征峰,在1070 cm-1處是連接羥基的C-O-的伸縮振動(dòng)吸收峰,928 cm-1位置是α-D-3,6內(nèi)醚半乳糖上C-O-C的特征吸收峰,848 cm-1處為半乳糖C4-O-S的伸縮振動(dòng)吸收峰[14-15]。

圖6 未改性κ-卡拉膠(KC)、 改性卡拉膠(HRKC)的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of κ-carrageenan and modified carrageenan

與未改性的κ-卡拉膠紅外圖譜相比,改性卡拉膠在1624 cm-1處的吸收峰減弱,而1424 cm-1位置有了新的吸收峰,即羧甲基的-COO-的特征吸收峰;1327 cm-1處吸收峰的強(qiáng)度增加,表明連接羥基的C-O-鍵的數(shù)量增多了;3420 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度有所減弱,表明在羥基相連接的位點(diǎn)發(fā)生了取代。由此表明,改性卡拉膠的糖單元結(jié)構(gòu)中有羧甲基官能團(tuán)引入;其它吸收峰未改變,說明卡拉膠的糖單元結(jié)構(gòu)沒有被破壞。

圖7 未改性κ-卡拉膠核磁共振圖Fig.7 13C-NMR spectra of κ-carrageenan

圖8 改性卡拉膠核磁共振圖譜Fig.8 13C-NMR spectra of modified carrageenan

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對κ-卡拉膠進(jìn)行螺桿擠壓預(yù)處理后,再進(jìn)行羧甲基化反應(yīng)改性,優(yōu)化了羧甲基化的反應(yīng)條件,并結(jié)合紅外光譜掃描及核磁共振對其改性機(jī)理進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:通過響應(yīng)面法優(yōu)化羧甲基化反應(yīng)結(jié)合實(shí)際反應(yīng)條件，修正后確定的優(yōu)化條件為:氯乙酸鈉添加量0.02 mol、羧甲基化反應(yīng)溫度65 ℃、乙醇濃度69%。在此條件下制備的改性卡拉膠的析水率為0.16%、凝膠強(qiáng)度為205 g/cm2,與未改性卡拉膠相比,析水率降低了96.5%,凝膠強(qiáng)度滿足

軟凝膠的要求。改性卡拉膠的糖單元結(jié)構(gòu)中引入了羧甲基官能團(tuán),原有的結(jié)構(gòu)未遭到破壞,因此析水率有效降低的同時(shí),凝膠強(qiáng)度亦明顯降低。