矢車菊素-3-葡萄糖苷與 四種乳蛋白相互作用的研究

王 鑫,趙 磊,郝 帥,劉國榮,王成濤,朱金錦

(北京工商大學(xué)，食品營養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心, 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048)

花色苷是一類天然水溶性多酚類物質(zhì),是花青素與各種糖以糖苷鍵結(jié)合而成的類黃酮化合物,主要存在于果蔬植物和谷類中[1-2]。近幾年,花色苷由于其潛在的營養(yǎng)和醫(yī)療價值而備受關(guān)注。有研究表明,花色苷具有抗炎、抗菌、降低血壓、提高視力和預(yù)防肝損傷等多種生理功能,對高血脂、肥胖等疾病也有一定的預(yù)防功能[3-7]。同時花色苷也是一種天然且安全的食用色素，在食品加工中得到了廣泛應(yīng)用。研究表明,花色苷與食品中的蛋白質(zhì)存在相互作用,HE等[8]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)對花色苷具有保護(hù)作用,因此研究花色苷和蛋白質(zhì)的相互作用具有重要意義。趙煥焦等[9]采用多光譜法研究黑米花色苷與酪蛋白之間的相互作用,發(fā)現(xiàn)黑米花色苷與酪蛋白可以發(fā)生結(jié)合并引起其構(gòu)象上的變化,推測出花色苷類成分在乳品中可以通過與酪蛋白相互作用，從而保護(hù)其抗氧化基團(tuán)在食品加工、儲運(yùn)和消化吸收過程中免遭破壞。Tang等[10]研究表明,矢車菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)和牛血清白蛋白之間存在復(fù)合作用,其中氫鍵是主要結(jié)合力。當(dāng)溶液pH大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時,多肽或蛋白質(zhì)與花色苷間還存在靜電相互作用[11]。然而,目前的報道多為花色苷提取物與蛋白相互作用的研究,而對某種特定花色苷與蛋白相互作用的研究比較缺乏。市面上許多乳制品中均含有花色苷,如金時代藍(lán)莓酸牛奶、蒙牛黑谷粒早餐牛奶、澳洲美可卓藍(lán)莓護(hù)眼牛奶咀嚼片、巧焙蔓越莓牛軋?zhí)堑?。C3G是自然界中最為常見的花色苷,含量最高[12],因此,選取C3G,研究其與4種常見乳蛋白的相互作用機(jī)制具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光光譜、紫外光譜、紅外光譜和圓二色譜,研究C3G與α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白之間的猝滅機(jī)理、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合力類型、結(jié)合距離等重要信息,并研究C3G對四種乳蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響,探究C3G與乳蛋白的相互作用機(jī)制,進(jìn)而進(jìn)一步探究乳蛋白對C3G的保護(hù)作用,為花色苷在乳制品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

矢車菊素-3-葡萄糖苷(≥98%) 四川省維克奇生物科技有限公司;α-酪蛋白、β-酪蛋白 Sigma公司;乳清蛋白、β-乳球蛋白 上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

F-4500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司;UV-2450型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;MOS-500型圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司;Avater 370型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司;YLE-1000型恒溫水浴鍋 北京市精科華瑞儀器有限公司;NK200-1B型氮吹儀 杭州米歐儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜的測定 用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4,0.01 mol/L)分別配制20 μmol/L的α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白溶液,設(shè)定為對照組。用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4,0.01 mol/L)分別配制20 μmol/L的α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白溶液,隨后向其中加入C3G,使得溶液中C3G的終濃度分別為0、5、10、20、30、40、50 μmol/L。在25、45、65 ℃下加熱15 min,設(shè)置激發(fā)波長為280 nm,于300～400 nm波長下測定對照組與反應(yīng)液的熒光發(fā)射光譜,并計(jì)算熒光猝滅率:

猝滅率(%)=1-(50 μmol/L C3G的蛋白最大發(fā)射波長熒光值/純蛋白質(zhì)最大發(fā)射波長熒光值)×100

式(1)

1.2.2 紫外光譜的測定 用0.01 mol/L PBS(pH7.4)配制10 μmol/L C3G溶液,室溫下以PBS溶液為空白對照，掃描300～400 nm內(nèi)的紫外吸收光譜。采用OriginPro 8.5軟件將C3G的紫外光譜分別與10 μmol/Lα-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白的熒光光譜重疊在一起繪制圖譜。

1.2.3 傅里葉紅外光譜的測定 用0.01 mol/L PBS(pH7.4)分別配制C3G與α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白摩爾濃度比為1∶1的混合溶液,濃度均為10 μmol/L,室溫下反應(yīng)15 min,再將其制成干燥粉末。KBr烘干6 h以上,所有樣品分別與100～200 mg干燥的KBr粉末混合壓片制得透明薄片進(jìn)行全波段(4000～500 cm-1)掃描,掃描次數(shù)為32次,分辨率為4 cm-1。

1.2.4 圓二色譜的測定 用0.01 mol/L PBS(pH7.4)分別配制C3G與α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白摩爾濃度比為1∶1的混合溶液。以PBS溶液為空白對照,在190～250 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)對待測樣品溶液進(jìn)行掃描,響應(yīng)時間為0.2 nm,狹縫寬度為2 nm,采集時間1 s/點(diǎn),CD測試范圍300～1000。采用OriginPro 8.5作圖,并聯(lián)合Dicroprot軟件中K2D方法和Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，計(jì)算出蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的組成與百分比。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)做三組,采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),用Tukey多重比較確定各均數(shù)間的顯著性差異,顯著水平為α=0.05。所有圖譜均采用OriginPro 8.5軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 C3G對乳蛋白的熒光光譜的影響

2.1.1 不同乳蛋白的熒光光譜測定 由圖1可知,在280 nm的激發(fā)波長,300～400 nm的發(fā)射波長范圍下C3G使α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白的熒光強(qiáng)度降低產(chǎn)生熒光猝滅作用,而且隨著C3G摩爾濃度增加,四種乳蛋白的熒光猝滅程度逐漸增大。當(dāng)C3G濃度為50 μmol/L時,對10 μmol/L的α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白的熒光猝滅率,分別達(dá)到84%、74%、77%和75%,四種乳蛋白相互比較,發(fā)現(xiàn)C3G對α-酪蛋白的熒光猝滅作用顯著(p<0.05)。在蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度降低的同時,其最大發(fā)射波長(λmax)也發(fā)生了變化。未加入C3G時,α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白的λmax分別為335、340、328和332 nm。四種乳蛋白λmax的數(shù)值都隨著C3G濃度的增大而增加,λmax發(fā)生紅移。研究表明,當(dāng)激發(fā)波長為280 nm時,色氨酸和酪氨酸共同提供蛋白質(zhì)的熒光光譜[13],因此,熒光圖譜紅移現(xiàn)象說明C3G影響了α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白中酪氨酸和色氨酸殘基的微環(huán)境,親水性增強(qiáng),疏水性減弱[14]。

圖1 矢車菊素-3-葡萄糖苷對α-酪蛋白(A)、β-酪蛋白(B)、乳清蛋白(C)、β-乳球蛋白(D)的熒光光譜的影響Fig.1 Effect of cyanidin 3-O-glucoside on intrinsic fluorescence of α-casein(A), β-casein(B),whey protein(C)and β-lactoglobulin(D)注:0:C(蛋白質(zhì))=10 μmol/L;1～6:C(C3G)=5、10、20、30、40、50 μmol/L。

2.1.2 C3G對乳蛋白熒光猝滅機(jī)理的判定 依據(jù) Stern-Volmer(S-V)方程可初步進(jìn)行判定猝滅類型[15]:

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ[Q]

式(2)

式中:F0為未加入C3G的熒光強(qiáng)度;F為加入C3G的熒光強(qiáng)度;[Q]為C3G的摩爾濃度(mol/L);Kq為猝滅速率常數(shù)(L/(mol·s));Ksv為Stern-Volmer(S-V)猝滅常數(shù)(L/mol);τ為生物大分子的熒光壽命(一般認(rèn)為平均壽命約為10-8s)。

各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數(shù)約為2×1010L/(mol·s)[16]。根據(jù)公式(1),以F0/F對[Q]進(jìn)行線性擬合(圖2),進(jìn)而得出不同溫度條件下C3G與乳蛋白相互作用的Ksv和Kq,結(jié)果見表1。

表1 不同溫度下四種乳蛋白與C3G的 Stern-Volmer的相關(guān)參數(shù)Table 1 Stern-Volmer correlation parameters of four milk proteins quenching caused by C3G at three different temperatures

圖2是C3G與α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白相互作用的S-V猝滅曲線,從圖可以看到猝滅曲線與猝滅劑濃度的關(guān)系基本上符合動力學(xué)猝滅方程。熒光猝滅是熒光物質(zhì)分子(即熒光體)與溶劑或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的物理或化學(xué)作用,基于物質(zhì)間的相互作用分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅[17]。

圖2 不同溫度下矢車菊素-3-葡萄糖苷與α-酪蛋白(A)、β-酪蛋白(B)、 乳清蛋白(C)、β-乳球蛋白(D)相互作用的Stern-Volmer曲線Fig.2 Stern-Volmer curves of cyanidin 3-O-glucoside interacting with α-casein(A), β-casein(B),whey protein(C)and β-lactoglobulin(D)at different temperatures

若猝滅常數(shù)大于2×1010L/(mol·s)時,屬于靜態(tài)猝滅;若猝滅常數(shù)小于2×1010L/(mol·s)時,屬于動態(tài)猝滅[18]。根據(jù)表1,乳清蛋白和β-乳球蛋白的Ksv隨溫度的上升而下降,即靜態(tài)猝滅常數(shù)下降,這說明C3G對乳清蛋白和β-乳球蛋白的熒光猝滅機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅。對于生物大分子,各類猝滅劑由擴(kuò)散碰撞產(chǎn)生的最大猝滅常數(shù)2×1010L/(mol·s),乳清蛋白和β-乳球蛋白的Kq遠(yuǎn)大于2×1010L/(mol·s),進(jìn)一步說明C3G對這兩種乳蛋白的猝滅機(jī)理是分子之間結(jié)合形成化合物所引起的靜態(tài)猝滅,而不是由分子擴(kuò)散和碰撞所引起的動態(tài)猝滅。α-酪蛋白的Ksv雖然隨溫度的升高而升高,但其Kq數(shù)量級為1012,不符合動態(tài)猝滅機(jī)理;同理,β-酪蛋白的Ksv和Kq也不符合動態(tài)猝滅機(jī)理。綜上初步判定,C3G對這四種乳蛋白的猝滅機(jī)制是基于形成不發(fā)光穩(wěn)定復(fù)合物的靜態(tài)猝滅，而不是由動態(tài)碰撞引起。

2.1.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算 在靜態(tài)猝滅過程中,可對公式(1)雙對數(shù)處理曲線方程,進(jìn)而計(jì)算結(jié)合常數(shù)Ks、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n:

lg[(F0-F)/F]=lgKS+nlg[Q]

式(3)

式中:F0,F,[Q]同2.1.2,Ks為C3G與蛋白質(zhì)結(jié)合常數(shù)(L/mol),n為C3G與蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。根據(jù)公式(2)以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]做直線,斜率為n,截距為lgKS。

從圖3看出,α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白的曲線成良好的線性關(guān)系,說明C3G與這四種乳蛋白的相互作用為靜態(tài)結(jié)合。KS代表結(jié)合常數(shù),KS值越大說明C3G與乳蛋白之間有較強(qiáng)的結(jié)合力。由表2可知,四種乳蛋白中α-酪蛋白的KS最大,其次是β-乳球蛋白,又根據(jù)熒光猝滅率結(jié)果得知C3G對α-酪蛋白的猝滅最明顯,從而推斷C3G與α-酪蛋白的靜態(tài)結(jié)合能力最強(qiáng)[19]。這四種乳蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n約等于1,由此可知C3G與這四種乳蛋白之間形成了摩爾比約1∶1的靜態(tài)復(fù)合物。且由表2結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高,KS的變化與n的變化一致,表明結(jié)合力越大,C3G結(jié)合到乳蛋白的結(jié)合位點(diǎn)越準(zhǔn)確。

表2 不同溫度下矢車菊素-3-葡萄糖苷與 四種乳蛋白的結(jié)合常數(shù)KS和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTable 2 Binding constants and and binding sites of four milk proteins and cyanidin 3-O-glucoside at different temperatures

圖3 不同溫度下α-酪蛋白(A)、β-酪蛋白(B)、乳清蛋白(C)、β-乳球蛋白(D)的lg[(F0-F)/F]與lg[Q]的關(guān)系圖Fig.3 Plots of lg[(F0-F)/F]and lg[Q]of α-casein(A),β-casein(B), whey protein(C)and β-lactoglobulin(D)at different temperature

2.1.4 熱力學(xué)參數(shù)與相互作用力類型 C3G與α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白之間的相互作用符合熱力學(xué)公式:

式(4)

ΔG=-RTlnKS

式(5)

ΔG=ΔH-TΔS

式(6)

式中:T為溫度(K);KS為該溫度下C3G與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)(L/mol);R為氣體常數(shù)(8.314 J/(mol·K));ΔG為生成自由能變(kJ/mol);ΔS為熵變(J/(mol·K));ΔH為焓變(kJ/mol);當(dāng)溫度變化不大時,反應(yīng)的ΔH、ΔS可看作常數(shù)。

小分子生物活性物質(zhì)和生物大分子之間的作用力主要有氫鍵、范德華力、疏水作用和靜電作用:當(dāng)ΔH<0、ΔS<0,主要作用力為范德華力和氫鍵;當(dāng)ΔH>0、ΔS>0,主要作用力為疏水作用;當(dāng)ΔH<0、ΔS>0,主要作用力為靜電作用[20],因此可以根據(jù)熵變(ΔS)和焓變(ΔH)判定兩者的作用方式[21]。從表3可以看出,C3G與所有乳蛋白結(jié)合的ΔG<0,說明C3G與乳蛋白之間的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的。其中,C3G與α-酪蛋白結(jié)合的ΔH<0,ΔS<0,說明C3G與α-酪蛋白的分子間作用力為氫鍵與范德華力;C3G分別與β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白結(jié)合后的ΔH和ΔS均符合ΔH<0,ΔS>0,這說明這三種乳蛋白與C3G之間主要靠靜電引力結(jié)合。C3G與乳清蛋白結(jié)合的ΔH<0,表明兩者之間的相互作用為放熱反應(yīng),降溫應(yīng)有利于反應(yīng)的進(jìn)行,則其KS值應(yīng)隨著溫度升高而減小。α-酪蛋白的ΔH<0,其KS符合這種規(guī)律(表2)。但β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白的KS不符合這種規(guī)律,可能是C3G在pH7.4環(huán)境中不穩(wěn)定,且加熱到65 ℃引起部分C3G降解或結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致與β-酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白結(jié)合更容易,因而65 ℃的結(jié)合能力比45 ℃下要高。

表3 矢車菊素-3-葡萄糖苷與乳蛋白復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermo dynamic parameters of C3G-milk protein complex

2.1.5 C3G與不同乳蛋白的結(jié)合距離 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明C3G與四種乳蛋白都形成了靜態(tài)猝滅的復(fù)合物,計(jì)算兩者之間的結(jié)合距離可以進(jìn)一步判斷出C3G與乳蛋白結(jié)合作用大小。根據(jù)F?ster’s的非輻射能量轉(zhuǎn)移理論,C3G與α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白的結(jié)合距離r0和能量轉(zhuǎn)移效率E之間有如下關(guān)系[22]:

式(7)

式(8)

式(9)

式中:F0,F同2.1.2;F(λ)為在波長λ時能量供體的熒光強(qiáng)度;ε(λ)為在波長λ時受體的摩爾吸光系數(shù)(L/mol);J為供體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分((cm3·L)/mol);R0是轉(zhuǎn)移效率為在50%時的F?ster臨界距離(nm);φ為供體的熒光量子產(chǎn)率,此實(shí)驗(yàn)取0.15;K2為偶極空間取向因子,取2/3;N為水和有機(jī)物折射指數(shù),取其平均值1.336。

以表2中C3G與四種乳蛋白結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1這一根據(jù),分別測定10 μmol/L乳蛋白的熒光光譜和10 μmol/L C3G的紫外光譜,如圖4所示。當(dāng)供體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜發(fā)生重疊時,且二者之間的最大距離小于7 nm時存在非輻射能量轉(zhuǎn)移[23]。表4中α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白與C3G結(jié)合距離r分別為2.17、2.66、2.18、2.19 nm,根據(jù)上述理論四種乳蛋白都符合非輻射能量轉(zhuǎn)移條件,也進(jìn)一步驗(yàn)證了C3G與四種乳蛋白的相互作用都是靜態(tài)猝滅。通過比較這四種乳蛋白與C3G結(jié)合距離大小,發(fā)現(xiàn)α-酪蛋白與C3G的結(jié)合距離最小,進(jìn)一步證明四種乳蛋白中α-酪蛋白與C3G的結(jié)合強(qiáng)度最大。

圖4 α-酪蛋白(A)、β-酪蛋白(B)、乳清蛋白(C)、β-乳球蛋白(D)的 熒光發(fā)射光譜與矢車菊素-3-葡萄糖苷的吸收光譜之間的重疊圖Fig.4 The fluorescence emission spectra of α-casein(A),β-casein(B),whey protein(C), β-lactoglobulin(D)and the UV absorption spectra of cyanidin 3-O-glucoside

表4 矢車菊素-3-葡萄糖苷 與四種乳蛋白的結(jié)合距離Table 4 Binding distance between cyanidin 3-O-glucoside and four kinds of milk proteins

2.2 C3G對乳蛋白紅外光譜的影響

α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白的紅外譜圖如圖5所示。C3G的加入引起α-酪蛋白的酰胺I帶從1650.40 cm-1移到1654.48 cm-1,而酰胺II帶從1527.81 cm-1移到1523.72 cm-1;β-酪蛋白的酰胺I帶從1642.22 cm-1移到1650.40 cm-1,而酰胺II帶從1523.72 cm-1移到1515.55 cm-1;乳清蛋白的酰胺I帶從1654.48 cm-1移到1650.40 cm-1,而酰胺II帶從1523.72 cm-1移到1519.64 cm-1;β-乳球蛋白的酰胺I帶從1646.31 cm-1移到1642.22 cm-1,而酰胺II帶從1523.81 cm-1移到1523.72 cm-1。紅外光譜的變化說明C3G對四種乳蛋白的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。α-酪蛋白和β-酪蛋白加入C3G后的酰胺I帶增強(qiáng),初步判定C3G使這兩種乳蛋白的α-螺旋增加;乳清蛋白和β-乳球蛋白加入C3G后的酰胺I帶減弱,表明其α-螺旋在加入C3G后降低了。

α-螺旋二級結(jié)構(gòu)的改變可以通過3300～3400 cm-1酰胺A帶(N-H伸縮振動)的改變來進(jìn)行輔證[24]。圖5明顯看到波數(shù)3300～3400 cm-1附近有一明顯寬峰,其代表蛋白質(zhì)的酰胺A帶,由N-H伸縮振動引起。C3G的加入引起α-酪蛋白的酰胺A帶波數(shù)從3423.84 cm-1右移至3338.02 cm-1,β-酪蛋白從3419.75 cm-1移至3317.59 cm-1,乳清蛋白從3301.25 cm-1移至3293.08 cm-1,β-乳球蛋白從3293.08 cm-1移至3288.99 cm-1。酰胺A帶的移動變化說明加入C3G后，這四種乳蛋白二級結(jié)構(gòu)中氫鍵化形式與程度改變了。

圖5 矢車菊素-3-葡萄糖苷與α-酪蛋白(A)、β-酪蛋白(B)、乳清蛋白(C)、β-乳球蛋白(D)相互作用紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of cyanidin 3-O-glucoside and α-casein(A), β-casein(B),whey protein(C),β-lactoglobulin(D)and their complexes

2.3 C3G對乳蛋白圓二色譜的影響

如圖6所示,對比α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白的圓二色譜圖,β-乳球蛋白在最大負(fù)峰的負(fù)橢圓率大于其他三種蛋白質(zhì),說明其α-螺旋含量最高,而α-酪蛋白和β-酪蛋白的圖形最相近,且都在215 nm附近有一個小肩縫,表示無規(guī)則卷曲[25]。α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白的負(fù)吸收峰分別位于203、199、207和214 nm,C3G使四種乳蛋白CD譜圖的負(fù)峰都向右紅移,且負(fù)峰的強(qiáng)度也有所變化,再次驗(yàn)證了C3G的加入對乳蛋白二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。從表5可直觀看到加入C3G后,α-酪蛋白的α-螺旋由7%升至8%,β-折疊和轉(zhuǎn)角從48%降至44%,無規(guī)則卷曲含量上升;β-酪蛋白的α-螺旋由5%到6%,β-折疊和轉(zhuǎn)角含量由38%升至41%,但無規(guī)則卷曲含量下降;乳清蛋白的α-螺旋、β-折疊和轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲均無明顯變化;β-乳球蛋白的α-螺旋從25%降到21%,β-折疊和轉(zhuǎn)角由25%升高至30%,與其他三種乳蛋白相比,C3G對β-乳球蛋白的α-螺旋、β-折疊和轉(zhuǎn)角的影響最大。研究表明,植物多酚化合物與球狀蛋白有著強(qiáng)烈的相互作用,并可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)展開[26]。C3G對β-乳球蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯的影響,其α-螺旋含量的降低預(yù)示著α-螺旋中氫鍵的斷裂使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散,可能轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角或無規(guī)則卷曲。綜上所述,圓二色譜的結(jié)果證明了C3G與這四種乳蛋白的相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的變化,其中對α-螺旋結(jié)構(gòu)的影響與紅外光譜結(jié)果一致。

圖6 矢車菊素-3-葡萄糖苷與α-酪蛋白(A)、β-酪蛋白(B)、乳清蛋白(C)、β-乳球蛋白(D)體系的圓二色譜圖Fig 6 CD spectra of cyanidin 3-O-glucoside and α-casein(A),β-casein(B),whey protein(C),β-lactoglobulin(D)system

表5 四種乳蛋白及其與C3G復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)含量Table 5 Secondary structure analysis from the free protein and their complexes

通過熒光光譜法發(fā)現(xiàn)C3G與α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白均可形成不發(fā)光的穩(wěn)定復(fù)合物產(chǎn)生靜態(tài)猝滅現(xiàn)象,且隨著C3G濃度的增加這四種蛋白質(zhì)熒光猝滅越明顯。由熱力學(xué)參數(shù)判定C3G與β-酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白分子間作用力為靜電引力,與α-酪蛋白分子間作用力為氫鍵與范德華力,結(jié)合力最強(qiáng)。通過紅外光譜法和圓二色譜法的測定得出C3G對α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響,對β-乳球蛋白的二級結(jié)構(gòu)影響最大。且加入C3G后α-酪蛋白和β-酪蛋白的α-螺旋含量增加,而乳清蛋白和β-乳球蛋白的降低。

3 結(jié)論

C3G與α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白之間有較強(qiáng)的相互作用,與α-酪蛋白分子間作用力為氫鍵與范德華力,與β-酪蛋白、乳清蛋白和β-乳球蛋白間作用力主要是靜電引力,并與α-酪蛋白結(jié)合最緊密。紅外光譜和圓二色譜均表明C3G與四種乳蛋白相互作用引起乳蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。本文闡述了C3G與四種乳蛋白之間的相互作用機(jī)制,為其生物學(xué)特性的深入研究和工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)開發(fā)提供一定依據(jù)。此外,C3G與四種乳蛋白相互作用的影響因素以及相互作用機(jī)制的了解還不夠全面,四種乳蛋白對C3G的保護(hù)作用仍需進(jìn)一步深入研究。最終將其廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域,合理利用兩者之間的相互作用,確保在不破壞食品品質(zhì)的基礎(chǔ)上,充分發(fā)揮C3G的功能特性。