金雞毛草水提取物對2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激及主動脈粥樣硬化的影響研究*

樂 暾，牟華明△，李 晶，王 蕾，桑 俊，舒朝林

(重慶三峽中心醫(yī)院：1.心血管內(nèi)科；2.中心實驗室 404000)

糖尿病是一種因機體糖脂代謝紊亂為主的慢性疾病，2型糖尿病占整個糖尿病群體的90%。隨著社會的進步，人們生活水平的提高和生活方式的改變，2型糖尿病發(fā)病率迅速增加[1]。長期的高血糖可引起一系列改變，繼而引發(fā)大量并發(fā)癥，最終導(dǎo)致患者殘疾或死亡。而大血管病變是2型糖尿病致死致殘的主要原因，其主要表現(xiàn)是動脈粥樣硬化。因此控制血糖濃度，對預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥有重要意義。傳統(tǒng)的中醫(yī)在治療和預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥方面具有很大的優(yōu)勢，金雞毛草(Gynura divaricata)為菊科多年生草本植物，也稱白背三七、白子菜，其性涼，味甘，有清熱解毒、舒筋接骨、涼血止血、散瘀消腫之功效，作為一種傳統(tǒng)的藥用植物，常用于治療糖尿病、高血壓風濕熱、百日咳、臃癰瘡癤等疾病[2]。研究表明[3-4]金雞毛草水提取物具有降低血糖作用。氧化應(yīng)激在糖尿病大血管病變的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用[5]。本實驗旨在探討金雞毛草水提取物對2型糖尿病大鼠機體氧化應(yīng)激和大血管病變的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗藥物 本實驗所用藥材由重慶三峽中心醫(yī)院中醫(yī)科鄭邦本教授和重慶醫(yī)科大學董志教授鑒定為菊科植物金雞毛草。按文獻[6]以10倍量水提取金雞毛草材料2次，每次2 h過濾，合并濾液，醇沉，濃縮至2.0 g生藥/mL浸膏，保存至4 ℃冰箱備用。鹽酸二甲雙胍片購于天方藥業(yè)有限公司(批號：161209123)。

1.1.2實驗動物 選取SPF級SD雄性大鼠，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK(渝)2012-0001。所有大鼠均在重慶醫(yī)科大學動物實驗中心SPF級屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)，自由攝食飲水，環(huán)境安靜。

1.1.3飼料 高脂高糖飼料(10%豬油、20%蔗糖、2.5%蛋黃，67.5%基礎(chǔ)飼料)、普通飼料均由北京市科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.1.4試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自美國Sigma 公司(批號：10120791)，檸檬酸、檸檬酸鈉、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，胰島素(INS)試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司(批號：201702)。

1.1.5主要儀器 瑞特血糖儀(華廣生技股份有限公司，型號：GM300)及配套血糖試紙；COBAS INREGRA 800全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)；400c型低速醫(yī)用離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)；Thermo Fisher 1510酶標儀(美國)；UV-5200PC型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；1-14ED切片機(德國Thermo Electron LED GMBH)。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立 根據(jù)文獻[7-8]方法，選取100只80～100 g體質(zhì)量SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由進食、飲水。選取10只大鼠作為空白對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，其余90只大鼠予以高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，所有大鼠禁食不禁水12 h。按40 mg/kg體質(zhì)量的劑量一次性腹腔注射1%STZ液(低溫、避光配置，現(xiàn)配現(xiàn)用，30 min內(nèi)使用完)造模，空白對照組給予等劑量檸檬酸緩沖液腹腔注射。3 d后大鼠尾靜脈采血，測空腹血糖，選取血糖大于或等于16.7 mmol/L[3,7]，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿的大鼠進行后續(xù)實驗。空白對照組大鼠繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)，造模大鼠繼續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)4周，期間每周尾靜脈采血測1次血糖，剔除血糖低于16.7 mmol/L的造模大鼠以確保2型糖尿病大鼠模型穩(wěn)定性。

1.2.2分組與給藥 選取成功造模的50只2型糖尿病模型大鼠分為5組，模型組、金雞毛草水提取物組(16、8、4 g生藥/kg)和二甲雙胍組(0.2 g/kg)。空白對照組及模型組分別予以等體積生理鹽水，其余組給予不同劑量金雞毛草水提取物和二甲雙胍灌胃，每天給藥1次，連續(xù)4周。每周日測1次大鼠體質(zhì)量(計算灌胃藥物量)和血糖。

1.2.3標本收集及檢測 實驗?zāi)┢冢写笫蠼巢唤?2 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，頸總動脈插管取血10 mL，放入抗凝管中，經(jīng)3 500 r/min離心15 min，分離血清備檢。通過生化分析儀檢測大鼠血脂；按照試劑盒說明書操作方法采用ELISA法檢測INS，羥胺法、TBA法在紫外可見分光光度劑550 nm、532 nm測定吸光度，并計算T-SOD、MDA水平；按照試劑盒說明書用紫外可見光光度計412 nm測定吸光度并計算GSH-Px。留取胸主動脈，予以10%甲醛固定，經(jīng)洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片處理后，進行HE染色，通過光學顯微鏡觀察主動脈組織病理形態(tài)學改變并照相。

2 結(jié) 果

2.1金雞毛草水提取物對2型糖尿病大鼠血糖的影響 金雞毛草水提取物各組、二甲雙胍組、模型組大鼠血糖與空白對照組比較，均明顯升高(P<0.01)；金雞毛草水提取物各組起效時間較二甲雙胍慢，灌胃14 d后開始起效(P<0.05)，其降糖作用呈劑量依賴性增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2金雞毛草水提取物對2型糖尿病大鼠血脂、血清INS的影響 與空白對照組比較，模型組膽固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、胰島素(INS)水平均升高(P<0.05)；金雞毛草水提取物各組及二甲雙胍組CHOL、TG、HDL-C、INS水平與模型組比較均明顯下降(P<0.01)；金雞毛草水提取物各組與二甲雙胍組比較，均有降低血脂的作用，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；對INS水平均有降低作用，但效果較二甲雙胍組明顯(P<0.01)，見表2。

表1 金雞毛草水提取物對2型糖尿病大鼠血糖的影響

a:P<0.01，與空白對照組比較；b:P<0.05，c:P<0.01，與模型組比較

表2 金雞毛草水提取物對2型糖尿病大鼠血脂、INS的影響

a:P<0.01，與空白對照組比較；b:P<0.05，c:P<0.01，與模型組比較；d:P<0.01,與二甲雙胍組比較

表3 金雞毛草水提取物對2型糖尿病大鼠血清MDA、T-SOD、GSH-PX的影響

a:P<0.01，b:P<0.05，與空白對照組比較；c:P<0.01，與模型組比較；d:P<0.01,與二甲雙胍組比較

A:空白對照組；B:模型組；C:金雞毛草水提取物高劑量組；D:金雞毛草水提取物中劑量組；E:金雞毛草水提取物低劑量組；F:二甲雙胍組

2.3金雞毛草水提取物對2型糖尿病大鼠血清MDA、T-SOD、GSH-PX水平的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠血清MDA水平增高(P<0.01),T-SOD、GSH-PX水平下降(P<0.05)。金雞毛草水提取物各組、二甲雙胍組MDA水平較模型組明顯下降(P<0.01)。與二甲雙胍組比較，金雞毛草水提取物高劑量組MDA水平降低(P<0.05)，中、低劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。金雞毛草水提取物各組、二甲雙胍組T-SOD、GSH-Px較模型組明顯增高(P<0.01)；金雞毛草水提取物各組T-SOD水平與二甲雙胍組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；金雞毛草水提取物高劑量組GSH-Px較二甲雙胍組增高(P<0.01)，中、低劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4主動脈病理變化 模型組大鼠動脈有動脈硬化，但是動脈硬化程度不重，偶可見泡沫細胞。金雞毛草水提取物各組、二甲雙胍組動脈硬化病理變化均不明顯，與空白對照組比較變化不大，血管內(nèi)皮細胞基本完整，未見明顯泡沫細胞，見圖1。

3 討 論

氧化應(yīng)激是2型糖尿病并發(fā)癥血管病變發(fā)展的基礎(chǔ)。正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)不斷產(chǎn)生活性氧代謝產(chǎn)物(ROS)，并被細胞內(nèi)外的抗氧化系統(tǒng)清除，保持平衡，不會造成氧化損傷；如果ROS的產(chǎn)生和抗氧化防御之間明顯不平衡，就會引起細胞的破壞和損傷[9-10]。高血糖通過葡萄糖自身氧化和隨之產(chǎn)生的糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，糖尿病時機體處于明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究顯示，模型大鼠血糖、血脂、INS水平較空白對照組增高，存在多飲、多食、多尿及胰島素抵抗，故而證實為2型糖尿病模型。

MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化典型的分解產(chǎn)物，間接反映機體細胞受氧自由基攻擊的程度[11]。同時脂質(zhì)過氧化是動脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵因素[12]，其水平可隨動脈粥樣硬化程度而增加。本研究結(jié)果顯示，模型組與空白對照組比較，MDA明顯升高，說明糖尿病機體氧化應(yīng)激水平是明顯增高的；金雞毛草水提取物治療后，各治療組與模型組比較MDA均明顯降低(P<0.01)，并且金雞毛草高、低劑量組治療有差異(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組MDA水平下降(P<0.05)，與金雞毛草低劑量組效果大致相同。說明金雞毛草水提取物及二甲雙胍均可減輕體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激對血管的損傷，降低機體氧化應(yīng)激水平及血管動脈粥樣硬化風險，并隨藥物劑量的增加而增強。本研究結(jié)果顯示，模型組與空白對照組比較T-SOD、GSH-Px水平明顯下降，經(jīng)金雞毛草水提取物及二甲雙胍治療后，T-SOD、GSH-Px水平升高(P<0.01)。T-SOD能清除體內(nèi)超氧陰離子自由基，GSH-Px 是機體內(nèi)一種重要的過氧化物分解酶[13]，SOD、GSH-Px是反映機體清除氧化自由的能力，機體抗氧化損傷的重要屏障。研究表明[14]，SOD促進過多的脂質(zhì)在體內(nèi)經(jīng)分解途徑而被氧化，從而減輕了過氧化物對動脈壁的直接損傷作用，較好地保護了內(nèi)皮細胞的完整性，在一定程度上抑制了動脈粥樣硬化的發(fā)生及減輕了病變的程度。GSH-Px存在于幾乎所有的活細胞中，也被認為是細胞水平上氧化還原失衡的生物標志物,它能使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能。本研究結(jié)果說明金雞毛草水提取物具有清除自由基的功能，提高機體抗氧化能力；同樣，本研究顯示二甲雙胍也具有清除自由基，抗氧化能力，這種機制可能與降低血糖關(guān)系密切。但金雞毛草水提取物各治療組增高T-SOD、GSH-Px的能力不同，劑量越大，抗氧化能力越強。

多數(shù)研究證實[13,15]，2型糖尿病血管病變與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，是血管動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵，并可以通過降低機體氧化應(yīng)激水平，降低脂質(zhì)過氧化，提高機體抗氧化能力，增強機體氧自由基清除，減輕氧化應(yīng)激對血管的損傷，進而達到保護作用。本研究血管標本病理結(jié)果證實，金雞毛草水提取物組及二甲雙胍組較模型組大鼠血管動脈粥樣硬化程度減輕，但各組標本血管動脈粥樣硬化程度均不明顯，這可能是因血管病變處于初期，模型時間不足等原因造成，有待進一步實驗繼續(xù)研究。

二甲雙胍在臨床上作為2型糖尿病一線用藥，其療效得到臨床肯定。金雞毛草水提取物各組降血糖起效較二甲雙胍組慢，但實驗?zāi)┢谧罱K結(jié)果比較無明顯差異，說明金雞毛草水提取物對2型糖尿病有降血糖的作用，與文獻[3-4]研究一致。金雞毛草水提取物組改善胰島素抵抗水平及其抗氧化能力與二甲雙胍組有一定差異，但不明顯，亦說明金雞毛草水提取物有改善胰島素抵抗水平及其抗氧化能力。

綜上所述，金雞毛草水提取物可改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂，降低氧化應(yīng)激水平，提高抗氧化應(yīng)激能力，對2型糖尿病模型大鼠大血管病變起到保護作用。由于實驗時間有限，仍需進行反復(fù)實驗為臨床提供更好的理論依據(jù)，并需從更多方面進行進一步深入研究。