高通量種子切片技術(shù)研究及其在作物育種中的應(yīng)用

翟晨光 劉龍飛 姚 遠 景海春 盧 洪*

1 中玉金標記（北京）生物技術(shù)股份有限公司 北京 102206

2 中國科學(xué)院 重大科技任務(wù)局 北京 100864

3 中國科學(xué)院植物研究所 北京 100093

我國人口眾多，農(nóng)作物種業(yè)是保障國家糧食安全和支撐農(nóng)業(yè)發(fā)展的根本所在，已經(jīng)成為國家戰(zhàn)略性、基礎(chǔ)性核心產(chǎn)業(yè)。作物育種技術(shù)的發(fā)展將增強我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)品競爭力，加快農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化，促進我國由農(nóng)業(yè)大國向農(nóng)業(yè)強國轉(zhuǎn)變[1,2]。我國種業(yè)技術(shù)近幾年發(fā)展較快，在作物育種領(lǐng)域已經(jīng)開始推廣應(yīng)用分子標記輔助育種。該技術(shù)借助分子標記的基因分型結(jié)果，從數(shù)萬個群體中選擇最優(yōu)的后代用于育種，可縮短育種年限，在有限的空間內(nèi)擴大育種規(guī)模，且群體越大選擇效率越高。但隨著育種規(guī)模的擴大，用于分子檢測的樣品取樣效率和質(zhì)量成為分子輔助育種的技術(shù)瓶頸。傳統(tǒng)的做法是把育種群體的種子全部種植到實驗田里，從田間進行葉片取樣，然后進行基因型檢測分析并決定取舍。該做法存在著占地面積大、耗時長、效率低、易出錯的問題，并且在田間種植的育種群體中有 80% 以上植株的基因型不符合預(yù)期，早晚要被淘汰掉，這嚴重地浪費了育種資源和育種者的精力。有了種子切片機的幫助，在播種前，利用種子切片技術(shù)對種子進行微量取樣，通過分析微量樣品的分子標記信息即可獲得相應(yīng)種子的基因型信息，然后只需將符合預(yù)期基因型的種子種植田間，即在播種之前完成了基因型選擇，這樣就大大縮小了群體種植規(guī)模，不僅節(jié)省了大量的田間工作而且讓育種者更加專注于復(fù)雜農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀的選擇。高通量種子切片機的制造技術(shù)原來一直被國際種業(yè)公司壟斷，并且不對外提供任何服務(wù)。切片技術(shù)的落后成為我國實施分子標記輔助育種的一大障礙。

為了打破國際種業(yè)公司在該領(lǐng)域的技術(shù)壟斷，中玉金標記（北京）生物技術(shù)股份有限公司（以下簡稱“中玉金標記”）與中國科學(xué)院植物研究所合作進行了 2 年多的聯(lián)合攻關(guān)，終于取得了具有自主知識產(chǎn)權(quán)、可以投入商業(yè)化使用的種子微創(chuàng)取樣設(shè)備——玉米種子切片機，且設(shè)備集成化、自動化程度非常高，占地面積不到 4 平方米。該設(shè)備將準備好的樣品倒入儲料斗，并與收集用的 96 孔板集中放入便攜式 96 孔板籃，之后只需啟動運行程序，設(shè)備就自動完成從單粒分揀到最后收集的所有過程。整套設(shè)備操作方便快捷、切割精確快速、樣品收集準確無誤。玉米種子切片一次操作處理 960 粒種子，每 6 秒可完成一粒種子取樣，成功率達 95% 以上，田間成活率達 95% 以上。

玉米種子切片機是我國自主研發(fā)的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、高通量自動化的大型科研設(shè)備，該設(shè)備的商業(yè)化標志著我國已經(jīng)成功地打破了國際公司在該技術(shù)領(lǐng)域的壟斷，實現(xiàn)了中國創(chuàng)造和中國制造。并且我國分子育種技術(shù)已經(jīng)突破了種子高通量取樣的技術(shù)瓶頸，這對我國的分子育種技術(shù)發(fā)展和實施具有重要意義。該技術(shù)的成功研發(fā)也是我國科研單位（中國科學(xué)院植物研究所）與企業(yè)（中玉金標記）共同努力的結(jié)果，是我國科企聯(lián)合政策結(jié)出的碩果。

1 種子切片技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

1.1 國際現(xiàn)狀

分子育種技術(shù)發(fā)展帶動著新的育種模式的形成。種子切片技術(shù)是作物分子育種過程中一項關(guān)鍵性的技術(shù)，取樣質(zhì)量和效率影響著育種規(guī)模[3-5]。國際育種公司早已意識到種子切片設(shè)備在作物分子標記輔助選擇育種中的應(yīng)用價值，并開始研發(fā)相關(guān)技術(shù)。2007 年，美國孟山都公司公布了種子切片技術(shù)（chipping process）在玉米、大豆育種中的應(yīng)用。它利用光譜進行種子定向，用激光或機械刀片對籽粒進行精確切割，切下的切片用 96 孔板收集，每天可以處理上萬粒種子[6]。種子切片技術(shù)的應(yīng)用，將多性狀整合育種（multiple trait integration，MTI）中的種子性狀，由原來的 8 個增至 20 個[3]。2008 年，美國杜邦旗下的先鋒高級育種國際有限公司（以下簡稱“先鋒公司”）公布種子微創(chuàng)切片技術(shù)（又稱“激光輔助選種技術(shù)”，laser-assisted seed selection），通過將磁性漆噴涂在種子頂部表面定位，然后用激光射線切取籽粒頂部少量胚乳組織，取樣后的種子仍保持發(fā)芽活性[6,7]。

國際種業(yè)大公司非常重視種子切片技術(shù)的壟斷，并通過它來限制競爭對手擴大育種規(guī)模。他們通常在研發(fā)成功某項種子切片技術(shù)后馬上對相關(guān)技術(shù)進行專利申請，并限制相關(guān)技術(shù)研發(fā)。2012 年，孟山都公司在美國圣路易斯聯(lián)邦地方法庭對先鋒公司的“激光輔助選種”提出侵權(quán)訴訟，雖然二者最終和解，但他們?nèi)灾萍s著這項技術(shù)的進一步使用[8]。由于國際種業(yè)大公司在種子切片技術(shù)方面的先發(fā)優(yōu)勢、壟斷地位、自行研制使用等原因，國際市場上至今還沒有商品化的種子切片設(shè)備。

1.2 國內(nèi)現(xiàn)狀

為打破國際種業(yè)大公司在種子切片技術(shù)上的壟斷，我國研究單位和種業(yè)公司開始著手研發(fā)自主種子切片設(shè)備，主要有中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院、中國科學(xué)院沈陽自動化研究所、沈陽理工大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、中玉金標記和河南農(nóng)業(yè)大學(xué)等，相關(guān)技術(shù)研發(fā)進展迅速。2014 年，李露等[9]發(fā)明了一種利用激光進行種子切片的全自動種子切片機；2015 年，王喜慶等[10]發(fā)明了“高通量種子自動化取樣及陽性種子挑選系統(tǒng)及方法”，描述了通過激光進行切割種子自動取樣的設(shè)備和方法，并獲得國家知識產(chǎn)權(quán)局授權(quán)；同年，魏英姿等[11]發(fā)明了一種雙層轉(zhuǎn)盤式育種激光自動切片取樣機，并獲得國家專利授權(quán)；2016 年，楊小東[12]在其畢業(yè)論文中描述了利用激光自動切割種子取樣的方法；同年，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)李慧琴等[13]發(fā)明了玉米育種自動取樣機并獲得國家專利授權(quán)；2017 年，谷侃鋒等[14]發(fā)明玉米育種取樣自動切片機，可利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模式進行玉米種子識別定位，再用激光進行切割，并獲得中國專利授權(quán)。目前，我國自主研發(fā)的種子切片相關(guān)技術(shù)已經(jīng)在國家知識產(chǎn)權(quán)局提交 20 多項相關(guān)專利申請，其中 10 余項已經(jīng)獲得中國專利授權(quán)。然而，到目前為止，只有中玉金標記做出了成熟的、可以量產(chǎn)的高通量種子切片機。

在 2017 年第四屆國際農(nóng)業(yè)基因組大會上，中玉金標記公布了我國第一套商品化的玉米種子切片和挑選設(shè)備[15]，為玉米分子育種提供了種子處理的全套技術(shù)解決方案，它包括全自動種子微創(chuàng)取樣設(shè)備、種子挑選設(shè)備和相應(yīng)的信息管理系統(tǒng)。種子微創(chuàng)取樣設(shè)備可以對每一代分離群體進行種子批量取樣，微創(chuàng)后的種子活力不受影響；通過檢測微量樣本獲得種子的遺傳信息后，玉米種子挑選設(shè)備根據(jù)種子基因型信息自動把目標種子從海量的群體中挑選出來；在管理系統(tǒng)中，微創(chuàng)種子、切片樣本和基因型一一對應(yīng)，可以對種植在大田中的每一株種苗進行跟蹤。全自動種子切片系統(tǒng)與高通量分子檢測技術(shù)相結(jié)合，形成一套完整的作物分子輔助選育技術(shù)方案（圖1），標志著我國分子育種在群體取樣技術(shù)和目標種子挑選技術(shù)方面已經(jīng)突破了“瓶頸”，達到一個新的水平。

圖1 高通量分子標記輔助選擇育種流程

2 高通量種子切片技術(shù)

分子標記輔助選擇育種是利用分子標記與目標性狀基因緊密連鎖的特點，從育種群體中篩選具有目的性狀的個體，可有效減少育種個體數(shù)量，縮短育種周期，從根本上解決了傳統(tǒng)育種性狀鑒定不準確、成本高和周期長的問題[16-18]。在 21 世紀初，國際種業(yè)公司如孟山都、先鋒公司等已經(jīng)采用新一代的單核苷酸多態(tài)性（SNP）分子標記檢測技術(shù)，它具有檢測快速、成本低、通量大的特點[6,19]。隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展和育種規(guī)模的擴大，群體取樣已經(jīng)成為分子標記輔助選擇育種的瓶頸。田間葉片取樣存在著效率低、易出錯的問題，并且在田間種植的育種群體中有 80% 以上植株在苗期被丟棄，嚴重地浪費了育種資源。在播種前，利用種子切片技術(shù)對種子進行微量取樣，通過分析樣品可獲得種子的遺傳信息，而后將所期望基因型的種子種植于田間，這樣則大大縮小了群體種植規(guī)模。

自動種子切片技術(shù)與高通量分子檢測技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)形成一種新的育種模式，從而可從數(shù)萬籽粒中選出最優(yōu)的一粒參與育種，使育種效率和規(guī)模成倍提高[7,18]。規(guī)?；N群體產(chǎn)生的種子數(shù)量巨大，而其中的優(yōu)質(zhì)種子極少，這就要求種子切片機自動化程度高，能從大量的種子中分離出單粒種子；然后對單粒種子逐一進行準確識別和特定部位精確切割，以保證后期種子較高的成活率；最后對取得的微量樣品和切片后的種子準確無誤地進行一一對應(yīng)收集，以保證通過樣品獲得的基因型和種子相對應(yīng)。

一個典型的全自動種子切片設(shè)備主要包括自動供料裝置、種子方向識別裝置、種子抓取轉(zhuǎn)移裝置、取樣裝置、樣品收集裝置以及控制和信息管理系統(tǒng) 6 個部分（圖2）。在信息管理控制的指揮下，自動供料裝置從批量的種子中分離出單粒種子；再經(jīng)過種子方向識別后，調(diào)整種子方向運輸至取樣平臺；然后對種子進行精確取樣，收集裝置將樣品和微創(chuàng)種子一一對應(yīng)進行收集[7,9,10,13,14,20]。

圖2 玉米種子切片機原理

（1）自動供料裝置。自動供料裝置將待取樣種子批量裝載，并進行單粒種子分離運輸至種子識別平臺。其最主要的功能是單粒種子分離，主要采用的方法有旋轉(zhuǎn)盤分離法和振動盤分離法。旋轉(zhuǎn)盤分離法是通過圓盤旋轉(zhuǎn)把其凹槽中的單粒種子從批量種子中分離出來[7,20,21]，但這種方法僅適用于形狀較為規(guī)則、顆粒較大的種子，如玉米和大豆等；而振動分離盤很好地解決了種子外形的問題，它利用螺旋轉(zhuǎn)盤高頻振動使批量種子處于單層平面排列狀態(tài)，然后通過轉(zhuǎn)盤的螺旋轉(zhuǎn)動使種子由平面排列變?yōu)榫€性排列，單粒種子逐漸分離出來（圖3）[9-11,13]。

（2）種子方向識別裝置。對單粒種子進行方向識別，以利于隨后操作過程中種子抓取、定位和精確切割。主流的種子方向識別方法是通過計算種子外形某些特征來判斷方向[13,19]。這種方法主要用于形狀規(guī)則且特征明顯的種子，但對于玉米穗兩端籽粒、秈稻籽粒等外形不規(guī)則或特征不明顯的種子并不適用，而最新的圖像智能識別技術(shù)可以解決這一問題。李廣偉等[18]利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模式識別工具箱建立的模型，對玉米種子姿態(tài)識別準確率達 99% 以上，中玉金標記利用人工智能識別技術(shù)對秈稻籽粒方向進行識別，準確率達 99%（內(nèi)部數(shù)據(jù)）。先鋒公司在玉米激光切片技術(shù)上采用另一種方式，在種子頂端涂抹鐵基粉，通過磁性吸附種子頂端直接調(diào)整玉米種子方向[7]。

圖3 種子振動分離盤的原理（a）與實物（b）

（3）種子抓取轉(zhuǎn)移裝置。抓取已經(jīng)確定好方向的種子，然后轉(zhuǎn)移至取樣裝置上，并在這一過程中調(diào)整種子方向，便于取樣裝置對種子精確取樣。對于易于抓取的種子一般采用類似于鉗子的裝置直接抓取，對于近似橢圓的種子（如玉米、大豆等）一般采用真空吸附的方式進行種子吸附。轉(zhuǎn)運方式一般采用傳送帶或多軸機器人的方式。

（4）取樣裝置。固定種子并對種子進行精確取樣的裝置。根據(jù)種子形狀的不同，固定方式多種多樣，其中通過“V”型裝置對種子擠壓可以有效固定大多數(shù)種子。取樣方式主要有機械切割和激光切割兩種。需要根據(jù)不同的籽粒質(zhì)地及形狀選取不同的方法。中玉金標記玉米種子切片機采用復(fù)合的機械方式取樣，用圓形鋸從種子頂端下方切割 2/3，再以自上而下的沖切方式將種子樣品直接沖切至漏斗形收集導(dǎo)管。這種復(fù)合切割方式既避免了單一沖切方式的巨大沖切力對玉米硬質(zhì)籽粒的傷害，又避免了單一圓形鋸切割方式在完成切割后樣品切片落點不固定性的問題[21]。

（5）樣品收集裝置。將切割后的種子和切片樣品，通過管道收集并儲存的裝置。為準確記錄樣品和種子的對應(yīng)關(guān)系，多采用 96 孔板進行儲存；為加大取樣通量，最好加裝自動疊板。另外，必須有相應(yīng)的信息管理系統(tǒng)記錄收集過程中種子和切片的對應(yīng)關(guān)系信息，以便需要時進行數(shù)據(jù)追溯。

（6）控制和信息管理系統(tǒng)?？刂葡到y(tǒng)主要是精確控制種子分揀、識別、運輸、切割和收集等各個環(huán)節(jié)的相互關(guān)系，使整個取樣流程有序進行，除此之外還有紅外監(jiān)測、故障報警等功能。信息管理系統(tǒng)主要是用來記錄整個取樣流程中的各種信息，如故障信息、收集樣品儲存信息、切片后種子儲存信息、樣品和種子的對應(yīng)關(guān)系等，以保障取樣信息的可追溯性。

3 總結(jié)

在市場需求的驅(qū)動下，我國有多家單位投入到種子切片機的研發(fā)中，目前已有商品化的產(chǎn)品投入市場。但與國外種業(yè)大公司相比，在使用經(jīng)驗和產(chǎn)品成熟度上還有很大的差距。并且，與國外自行研發(fā)使用不同，我國商品化種子切片機需要更強的適用性，這給我們提出更大的挑戰(zhàn)。目前，中玉金標記聯(lián)合中國科學(xué)院植物研究所已經(jīng)成功研發(fā)出了玉米種子切片機，在水稻、小麥、大豆方面的種子切片機也在研發(fā)調(diào)試中，期望在不久的將來能夠推出商業(yè)化的相關(guān)切片設(shè)備，為中國種業(yè)的分子標記輔助育種做好服務(wù)。隨著我國作物分子標記輔助育種技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用范圍的擴大，種子切片機在主要作物育種領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。因此，我們必須在借鑒國外成功經(jīng)驗基礎(chǔ)上，立足我國國情，研發(fā)出適合中國市場的產(chǎn)品，促進分子標記輔助育種技術(shù)在我國的推廣應(yīng)用。