血管內(nèi)皮生長因子抑制劑對聲帶損傷修復(fù)作用的實驗研究

崔前波 章薇 袁琨 屈季寧

1 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院耳鼻咽喉科(武漢 430014)； 2 武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

聲帶發(fā)聲的基礎(chǔ)依賴其固有層的精細(xì)結(jié)構(gòu)，而固有層功能主要由細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中纖維蛋白、間隙蛋白含量的動態(tài)平衡來維持。感染、創(chuàng)傷、外科手術(shù)后的聲帶損傷如果發(fā)生于聲帶固有層，炎性細(xì)胞的浸潤可引起固有層深層的成纖維細(xì)胞大量合成纖維蛋白，同時間隙蛋白中透明質(zhì)酸(haluronic acid,HA)的丟失將導(dǎo)致這一結(jié)構(gòu)平衡破壞，形成聲帶的瘢痕愈合，影響發(fā)聲質(zhì)量;因此，增加損傷聲帶ECM中HA的含量及降低成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生是預(yù)防聲帶瘢痕形成的關(guān)鍵。有研究指出，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在這一過程中有重要的作用，能降低VEGF的表達強度，顯著抑制燒傷組織的瘢痕形成過程[1]，但目前VEGF在聲帶中的研究尚局限于息肉或腫瘤組織的生長過程[2,3]，其在聲帶損傷修復(fù)過程中的作用尚未明確。本研究擬通過在聲帶損傷修復(fù)模型家兔聲帶中注射VEGF單克隆抗體，觀測聲帶小血管的生成、固有層中纖維蛋白、透明質(zhì)酸的含量變化，為干預(yù)聲帶損傷修復(fù)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用普通實驗級家兔15只(來自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)，雌雄不限，兔齡12±3月，體重2±0.5 kg，實驗期間在武漢大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2建立家兔聲帶損傷模型 采用氯胺酮40 mg/kg、氟哌利多1.6 mg/kg肌肉注射麻醉動物，麻醉后于0°鼻內(nèi)鏡直視下用45°咬切鉗切除雙側(cè)聲帶前中部淺層，直至聲帶肌。

1.3VEGF單克隆抗體聲帶注射 造模過程中3只動物死亡，共12只家兔24側(cè)聲帶完成聲帶損傷模型建立。同法麻醉下，在0°鼻內(nèi)鏡直視下隨機選一側(cè)聲帶作為實驗組，用高壓注射器將生理鹽水稀釋到15 μg/ml的VEGF單克隆抗體200 μl進行聲帶上皮下注射，對側(cè)聲帶用等量生理鹽水進行同樣部位注射，作為對照組。

1.4聲帶大體形態(tài)學(xué)及組織學(xué)觀察

1.4.1聲帶取材 分別于術(shù)后第1、2、3、4 w各隨機取3只實驗兔麻醉后取雙側(cè)聲帶全層標(biāo)本，予以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后橫切片(厚度為5 μm)，每側(cè)聲帶以連續(xù)相鄰3張切片為1組，隨機抽取10組共30張，每組切片分別行HE染色、Alcian blue染色、Masson染色。

1.4.2聲帶HE染色 常規(guī)方式進行HE染色，鏡下細(xì)胞核呈鮮明的藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染成深淺不同的粉紅色；紅細(xì)胞染成橘紅色，肌肉組織染成深紅色，膠原纖維呈粉紅色。觀察聲帶上皮、固有層內(nèi)纖維組織、炎性細(xì)胞浸潤情況及小血管增生情況。

1.4.3聲帶Alcian blue染色 采用Alcian blue染色套裝操作，切片脫蠟至水后，先用Alcian blue染液染10～20分鐘，稍水洗，然后用核固定染液復(fù)染5～10分鐘，稍水洗，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封閉，光鏡下觀察，透明質(zhì)酸陽性染色為藍(lán)色，藍(lán)色越深表示HA含量越高。

1.4.4聲帶Masson染色 切片脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素(Weigert鐵蘇木素A、B等比例混合液)染5～10分鐘，流水稍洗；1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)分鐘；麗春紅酸性品紅染色液5～10分鐘，流水稍洗；磷鉬酸染液處理約5分鐘，不用水洗直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染5分鐘；1%冰醋酸處理約5分鐘，95%酒精多次脫水；無水酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封閉，光鏡下觀察。陽性染色呈藍(lán)色，藍(lán)色染色越深，膠原蛋白含量越高。

在40倍光學(xué)顯微鏡下，任意取5個視野拍照，圖像應(yīng)用Adobe Photoshop CS2 軟件量化分析切片染色圖像，分別計算聲帶固有層小血管、膠原纖維、透明質(zhì)酸在聲帶固有層所占的百分比。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，連續(xù)數(shù)值變量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布組間比較用Student’sT檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1聲帶HE染色結(jié)果 正常聲帶上皮層、固有層、肌層結(jié)構(gòu)清晰，同時固有層內(nèi)纖維排列有序，組織疏松；對照側(cè)術(shù)后1 w聲帶上皮不連續(xù)，大量炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)構(gòu)紊亂，伴小血管生成，術(shù)后2 w上皮細(xì)胞再生，上皮下疏松結(jié)締組織層變淺，組織無規(guī)律，層次結(jié)構(gòu)不清，術(shù)后3 w上皮基本連續(xù)，可見短纖維結(jié)締組織不規(guī)則出現(xiàn)，與肌層交接處仍可見活躍炎性細(xì)胞浸潤，術(shù)后4 w聲帶層次基本恢復(fù)，但部分損傷處能存在固有層菲薄，上皮下結(jié)締組織致密，肌層疏松。實驗側(cè)術(shù)后1 w僅可見血管組織減少，但其他鏡下表現(xiàn)與對照側(cè)無異，術(shù)后2 w可見固有層深處炎性細(xì)胞浸潤變少，極少血管網(wǎng)，固有層疏松度好于對照側(cè)，纖維結(jié)締組織連續(xù)性無明顯差異，術(shù)后3 w可見連續(xù)的纖維結(jié)締組織存在，固有層深處炎性細(xì)胞減少明顯，且固有層淺層組織纖維結(jié)締組織沉積少，術(shù)后4 w基本類似于正常聲帶(圖1)?？梢娦g(shù)后2 w實驗側(cè)血管增生活動明顯減弱，但鏡下觀察，二組聲帶愈合時間相同。

圖1 聲帶HE染色 a顯示未損傷聲帶,b～e顯示對照側(cè)聲帶損傷后1～4 w上皮及固有層變化,可見1～2 w固有層內(nèi)主要為增生腺體及紊亂結(jié)構(gòu),3～4 w開始修復(fù),結(jié)構(gòu)逐漸有序;f～i為實驗側(cè)聲帶注射VEGF單克隆抗體后聲帶固有層1～4 w變化,組織增生情況較對照側(cè)弱,少許小血管增生,炎性細(xì)胞浸潤于3 w后好轉(zhuǎn),兩組聲帶總體恢復(fù)時間基本類似(HE×40)。

2.2Alcian blue染色顯示固有層ECM中HA變化 對照側(cè)術(shù)后1 w固有層僅可見部分HA存在，無法查看到分布于全層的染色顆粒，術(shù)后2 wHA染色顆粒不明顯，術(shù)后3 w少許不連貫HA出現(xiàn)，術(shù)后4 w相比3 w無明顯好轉(zhuǎn)，實驗側(cè)術(shù)后1、2 w HA相比對照側(cè)無明顯變化，術(shù)后3 w團塊狀HA染色顆粒開始出現(xiàn)，術(shù)后4 w可見連續(xù)存在(圖2)；可見，VEGF單克隆抗體注射對HA的影響在術(shù)后4 w時才開始出現(xiàn)，與其對血管的影響時間上不完全吻合。

2.3Masson染色顯示固有層ECM中膠原纖維變化 對照側(cè)術(shù)后1 w存在炎性細(xì)胞浸潤，固有層淺層纖維組織少于深層，深層纖維組織致密紊亂，術(shù)后2 w纖維組織稍連續(xù)，但分布不均勻，術(shù)后3 w可見固有層從上到下纖維密度由深變淺，少許有序纖維，深層仍紊亂，術(shù)后4 w比較完整的連續(xù)纖維開始出現(xiàn)，深層可見伴小血管的纖維沉積帶;實驗側(cè)術(shù)后1 w表現(xiàn)相比對照側(cè)纖維組織增生活動類似，仍可見小血管，2 w后未出現(xiàn)伴小血管的纖維沉積帶，但固有層淺層纖維組織明顯疏松，3 w后未見明顯密集的纖維組織(P<0.05)，4 w后表現(xiàn)相比前一周更進一步減少(圖3)，說明抑制血管生成后隨即可出現(xiàn)膠原纖維蛋白分泌的減少，二者之間有相關(guān)性。

2.4兩側(cè)聲帶固有層小血管、膠原纖維、HA含量比較 表1顯示術(shù)后1 w時，兩側(cè)聲帶HA、膠原纖維蛋白及小血管組織的含量無明顯差異，術(shù)后2 w時，實驗側(cè)聲帶固有層中小血管生成較對照側(cè)明顯減少(P<0.05),其他無明顯差異，術(shù)后3 w時，小血管生成較對照側(cè)繼續(xù)減弱(P<0.05)，同時膠原纖維含量也較對照側(cè)減少(P<0.05)，而HA含量兩組無明顯差異；術(shù)后4 w時，實驗側(cè)聲帶固有層小血管生成較對照側(cè)明顯減少，HA含量明顯增多，膠原纖維減少更為明顯(均為P<0.05)。

表1 兩組術(shù)后1～4 w聲帶固有層小血管、膠原纖維、HA含量比較(%，±s)

注：*與對照側(cè)術(shù)后同時期相同組織類型含量相比較，P<0.05

3 討論

以往對損傷模型研究顯示，聲帶損傷后的修復(fù)以成纖維細(xì)胞增生并分泌ECM為主，其在損傷后3～40 d保持旺盛的膠原纖維分泌[4,5]，同時纖維連接蛋白的分泌可維持至半年后[6]，HA則會在15 d內(nèi)逐漸下降[7]，兩者比例失衡能引起膠原纖維的無序排列，同時ECM粘滯性降低，修復(fù)后聲帶硬化，雖然最終瘢痕形成需要長達12個月的修復(fù)過程，但一般認(rèn)為30 d內(nèi)上述ECM成分分布能決定最終是否形成瘢痕，這一時間段是聲帶損傷修復(fù)的關(guān)鍵時期[8]；為此，本研究觀察了聲帶損傷30 d內(nèi)的ECM主要成分變化，結(jié)果顯示對照側(cè)聲帶損傷后HA含量即開始下降，在術(shù)后3 w則轉(zhuǎn)為逐漸升高，而膠原纖維則至損傷后即開始升高，顯示修復(fù)可在創(chuàng)傷發(fā)生后即刻開始，但新生修復(fù)組織并不能產(chǎn)生足量的HA，修復(fù)過程還是以纖維蛋白的增生為主，與上述學(xué)者觀點基本相同。

圖2 聲帶中HA的Alcian blue染色 a正常聲帶固有層HA染色,b～e對照側(cè)聲帶損傷后1～4 wHA含量變化,可見1～3 w含量下降明顯,4 w含量增加;f～i實驗側(cè)損傷聲帶注射VEGF單克隆抗體后1～4 wHA變化,可見1～2 w也呈下降趨勢,但3 w后開始回升(Al-cian blue×40)。

圖3 聲帶固有層膠原纖維的Masson染色 a正常固有層內(nèi)少許纖維蛋白,且靠近固有層淺層,b～e對照側(cè)聲帶損傷后1～4 w從固有層深層及肌層開始的旺盛纖維蛋白增殖,f～i為實驗側(cè)聲帶注射VEGF單克隆抗體1～4 w變化,纖維增殖高峰出現(xiàn)于注射后2 w,后逐漸減弱,4 w時已基本恢復(fù)正常(Masson×40)。

創(chuàng)傷的修復(fù)一般伴有小血管的產(chǎn)生，而VEGF則是這一過程中最重要的因子，以往的研究表明VEGF能促進血管內(nèi)皮增生，局部微血管密度(MDV)增加，新生血管通透性增加，大量纖維素滲出，從而改變細(xì)胞外基質(zhì)成分。修復(fù)過程中增加的血流量及新生的血管可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的增長，并為其合成膠原纖維提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時小血管的通透性增加直接導(dǎo)致血漿蛋白的滲出。在這一過程中，增生的成纖維細(xì)胞還參與調(diào)節(jié)VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，兩者的相互作用將導(dǎo)致瘢痕組織的形成。有研究指出，透明質(zhì)酸(HA)與VEGF存在一定的相關(guān)性[9]，增加HA含量能降低VEGF的分泌，并且組織中HA含量的下降能增加VEGF的表達。同時，逐漸增生的瘢痕組織包繞血管生長，一定程度后可能壓迫血管，從而引起局部缺血缺氧，缺氧后血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙、小管形成能力增強且VEGFmRNA的表達增強，MDV增加，而MDV與病理性瘢痕形成有密切的關(guān)系[10～13]。從文中結(jié)果看，實驗側(cè)損傷聲帶注射VEGF單克隆抗體后，在術(shù)后2 w時產(chǎn)生明顯的抑制血管生成作用，同時膠原纖維含量開始逐漸減少，說明抑制VEGF能減弱小血管的生成，并通過上述機制減少膠原纖維的生成，而對照側(cè)術(shù)后2～3 w是小血管增生高峰期，VEGF單克隆抗體抑制小血管生成的能力可能隨著小血管網(wǎng)增生程度而增強，推測這一作用效應(yīng)可能與MDV增加后，血管內(nèi)皮受體數(shù)量增加有關(guān)，但本研究結(jié)果顯示觀察至4 w時，對照側(cè)仍有一定的小血管增生，而實驗側(cè)小血管生成較對照側(cè)進一步減少，提示VEGF單克隆抗體的抑制作用仍同時存在。術(shù)后2～3 w時實驗側(cè)與對照側(cè)HA的含量變化不明顯，說明單純抑制血管生成并不能直接提高HA含量，兩者無明顯相關(guān)性，術(shù)后4 w時實驗側(cè)HA含量的升高更多可能是新生組織分泌的結(jié)果。

現(xiàn)有對聲帶瘢痕的治療集中于恢復(fù)聲帶固有層的ECM、干預(yù)瘢痕形成等，主要的方式除手術(shù)治療外，側(cè)重于組織工程學(xué)修復(fù)，包括：注射間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及干細(xì)胞生長因子等，甚至包括直接注射體外ECM成分，目的是提高組織中HA含量和降低膠原蛋白的合成，恢復(fù)聲帶的彈性框架，但均未大規(guī)模應(yīng)用于臨床[14]。雖然目前VEGF單克隆抗體主要應(yīng)用于抑制腫瘤血管生長，但在燒傷科、美容科等領(lǐng)域的動物實驗已經(jīng)證實其能顯著減輕瘢痕形成，在鼠、兔損失后的瘢痕模型研究中，注射中等劑量VEGF單克隆抗體后，MVD明顯減少，瘢痕組織中膠原纖維減少，排列變成較為整齊，瘢痕組織體積縮小[15，16]。同樣本研究結(jié)果顯示，注射VEGF單克隆抗體能抑制損傷聲帶小血管生成、降低膠原蛋白的合成，與上述結(jié)果類似，說明注射VEGF單克隆抗體也能減輕聲帶瘢痕組織形成，其應(yīng)用于聲帶損傷修復(fù)、減輕瘢痕形成具有實際意義。