蛤蔞葉揮發(fā)油的提取工藝和成分分析

黃丹思 ，徐 飛，龐藝萌 ，鐘賽意，2，陳建平 ，2

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088；2.廣東省亞熱帶果蔬加工現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣東湛江 524088）

蛤蔞（Piper sarmentosum Roxb.）又名假蒟、假蔞、山蔞、巴巖香等，是胡椒科胡椒屬植物[1]。它主要分布于我國(guó)福建、廣東、海南、香港、臺(tái)灣、廣西、云南南部和西藏等省區(qū)[2-3]。作為一種傳統(tǒng)的中藥，蛤蔞具有廣泛的藥理活性，目前已發(fā)現(xiàn)蛤蔞具有鎮(zhèn)痛、抗病毒、抑制真菌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用[4]。蛤蔞富含酸類(lèi)、醚類(lèi)、醇類(lèi)和萜烯類(lèi)等多種活性物質(zhì)[5]。因此，研究蛤蔞的藥用價(jià)值對(duì)人類(lèi)健康具有重要意義，近年來(lái)從蛤蔞中提取精油并分析其成分已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[6]。王道平等人[7]采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析新鮮假蒟藥揮發(fā)性化學(xué)成分，結(jié)果顯示含有烯烴類(lèi)（72.5%）、醇類(lèi)（6.1%）、醛酮類(lèi)（3.5%）、雜環(huán)化合物（2.9%）、酯類(lèi)（3.4%）、有機(jī)酸（0.1%） 等6類(lèi)成分，其中單萜類(lèi)成分β-月桂烯含量高達(dá)34.4%。宋艷平等人[8]采用常規(guī)水蒸氣蒸餾法提取出假蒟精油，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)分析，鑒定出67種化合物，主要是2,4,5-三甲氧基-1-丙烯基苯（23.20%），順-石竹烯（13.33%），1,2-二甲氧基4-（1-丙烯基） 苯（12.63%），細(xì)辛腦（9.94%），4-甲氧基-6-（2-丙烯基） -1,3-苯并二惡茂（5.71%），δ-杜松烯（3.03%） 等。而目前對(duì)蛤蔞中揮發(fā)油的提純工藝卻未見(jiàn)報(bào)道。目前，揮發(fā)油的提取方法有水蒸氣提取法、超聲波輔助提取法、有機(jī)溶劑提取法、超臨界流體提取法等[9]，與其他提取方法相比，水蒸氣蒸餾法設(shè)備成本低、操作簡(jiǎn)單、條件簡(jiǎn)單且無(wú)污染(無(wú)溶劑殘留)，很多精油的提取都采用此方法[10-11]。因此，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用水蒸氣蒸餾法提取蛤蔞中揮發(fā)油，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS） 分析鑒定蛤蔞揮發(fā)油的化學(xué)成分，為蛤蔞中揮發(fā)油的綜合利用及其藥用資源的研究開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛤蔞新鮮葉，采自廣東省湛江市湖光巖野地生長(zhǎng)的植株；無(wú)水硫酸鈉（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

W120型島津托盤(pán)電子天平，東莞儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DRT-SX-型調(diào)溫電熱套，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；KQ-500DB型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9030型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Trace DSQ型氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)熱電公司產(chǎn)品。

1.3 蛤蔞葉揮發(fā)油的提取方法

將新鮮的蛤蔞葉清洗、曬干、粉碎后，過(guò)80目篩制成蛤蔞葉粉。取20 g蛤蔞葉粉，參照《中國(guó)藥典》 （2010年版） 附錄XD的水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油[12]。收集的揮發(fā)油用少許乙醚分?jǐn)?shù)次萃取，用無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥，低溫?fù)]去乙醚，稱(chēng)量揮發(fā)油的質(zhì)量，根據(jù)公式（1）計(jì)算蛤蔞葉揮發(fā)油得率。

式中：W1——蛤蔞葉揮發(fā)油質(zhì)量，g；

W0——蛤蔞葉粉質(zhì)量，g。

1.4 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化蛤蔞葉揮發(fā)油的提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蛤蔞葉揮發(fā)油得率為考查指標(biāo)，選取料液比（A）、浸泡時(shí)間（B）、提取時(shí)間（C），每個(gè)試驗(yàn)因素分3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.5 蛤蔞葉揮發(fā)油的GC-MS分析

1.5.1 色譜條件

色譜柱：TG-5MS彈性石英毛細(xì)柱管（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50℃，以4℃/min的速度升溫至100℃，保持2 min；再以8℃/min的速度升溫至250℃，保持3 min；再以5℃/min的速度升溫至260℃，保持3 min；接著以10℃/min的速度升溫至280℃，保持1 min。進(jìn)樣量1.0 μL，采用不分流的方式進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度50℃；檢測(cè)溫度280℃；載氣為氮?dú)?，過(guò)柱載氣恒流速為0.8 mL/min。1.5.2 質(zhì)譜條件

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

電子轟擊（EI） 離子源；電子能量70 eV；傳輸線(xiàn)溫度275℃；離子源溫度230℃；發(fā)射電流34.6 VA，電子倍增器電壓1 392 V；掃描質(zhì)量范圍50～500 m/z。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛤蔞葉揮發(fā)油最佳提取工藝條件的確定

蛤蔞葉中揮發(fā)油得率正交設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，蛤蔞葉中揮發(fā)油得率方差分析見(jiàn)表3。

表2 蛤蔞葉中揮發(fā)油得率正交設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 蛤蔞葉中揮發(fā)油得率方差分析

由表3分析結(jié)果可知，料液比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間對(duì)蛤蔞葉揮發(fā)油得率差異不顯著。根據(jù)表2中的R值可知，影響蛤蔞葉揮發(fā)油提取得率各因素主次關(guān)系為提取時(shí)間＞料液比＞浸泡時(shí)間，因此綜合上述分析結(jié)果，得出蛤蔞葉揮發(fā)油最優(yōu)提取工藝參數(shù)為A2B2C3，即料液比1∶15（g∶mL），浸泡時(shí)間3 h，提取時(shí)間7 h。在此提取條件下蛤蔞葉精油的提取率為0.340%。

2.2 蛤蔞葉揮發(fā)油的成分分析

根據(jù)最佳提取工藝，采用水蒸氣蒸餾法提取蛤蔞新鮮葉中的揮發(fā)油，利用GC-MS分析揮發(fā)油的組成，獲得譜圖。色譜分離后，質(zhì)譜裂解得到每個(gè)色譜峰的質(zhì)譜圖，查閱有關(guān)質(zhì)譜圖，共獲得22種化合物，通過(guò)峰面積歸一化法計(jì)算求出各化合物的峰面積相對(duì)含量。

蛤蔞葉揮發(fā)油的GC-MS圖譜見(jiàn)圖1，GC-MS鑒定蛤蔞葉揮發(fā)油中的化學(xué)成分見(jiàn)表4。

圖1 蛤蔞葉揮發(fā)油的GC-MS圖譜

通過(guò)GC-MS分析表明，水蒸氣蒸餾法所得的蛤蔞葉揮發(fā)油可分離出22個(gè)峰，標(biāo)準(zhǔn)譜圖和質(zhì)譜的裂解規(guī)律分析經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索的組分質(zhì)譜圖，鑒定出17種成分，占揮發(fā)油相對(duì)含量的97.69%（以峰面積計(jì)）。已鑒定的化合物主要包括醚（44.63%）、烯烴（30.75%）、酯類(lèi)（13.9%）、醇（6.67%） 等4類(lèi)化合物。其中相對(duì)含量大于10%的化合物有3種，大于2%的有7種。醚和烯烴物質(zhì)為揮發(fā)油中主要化合物，相對(duì)含量分別占44.63%和30.75%。由圖1和表1可知，β-細(xì)辛腦（29.7%）、石竹烯（25.32%）、乙醇過(guò)氧酸，氰基環(huán)己基苯基薄荷酯（13.90%）、肉豆蔻醚（7.62%）、甲基丁香酚（6.39%）為蛤蔞葉中揮發(fā)油的5種主要化合物。在上述化合物中，文獻(xiàn)報(bào)道石竹烯具有抗菌作用、抗炎作用、驅(qū)蚊蟲(chóng)作用、抗焦慮和抗抑郁活性；肉豆寇醚具有抗炎、增強(qiáng)5-羥色胺、抑制單胺氧化酶等作用，這些具有生物活性的揮發(fā)油成分的存在于蛤蔞葉中，為蛤蔞葉的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了有利的科學(xué)證據(jù)。

表4 GC-MS鑒定蛤蔞葉揮發(fā)油中的化學(xué)成分

3 結(jié)論

采用水蒸氣蒸餾法提取蛤蔞葉揮發(fā)油，在單因素基礎(chǔ)上，運(yùn)用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝，并采用GC-MS分析揮發(fā)油的組成成分，得到的結(jié)論如下：

（1）采用水蒸氣蒸餾法提取蛤蔞葉揮發(fā)油，最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶15（g∶mL），浸泡時(shí)間3 h，提取時(shí)間7 h，在此提取條件下蛤蔞葉精油的提取率為0.340%。

（2） 經(jīng)GC-MS測(cè)定，β-細(xì)辛腦（29.7%）、石竹烯 （25.32%）、Ethaneperoxoic acid，Cyanocyclohexylphenyl methyl ester（13.90%）、肉豆蔻醚（7.62%）和甲基丁香酚（6.39%） 是蛤蔞葉揮發(fā)油中主要的5種成分。