廣東黃酒中氨基甲酸乙酯的研究進(jìn)展

曹 甜，劉曉艷，白衛(wèi)東，錢(qián) 敏，劉功良，劉 露，闕慕儀

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.廣州市廣式傳統(tǒng)食品加工與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510225）

我國(guó)有著世界上最早的釀酒文化，黃酒更是作為民族代表酒而聞名于世，中國(guó)黃酒風(fēng)味獨(dú)特、甘醇爽口，且有著豐富的營(yíng)養(yǎng)，廣東一帶的婦女在月子期間常用黃酒煮雞肉來(lái)滋補(bǔ)身體，深受客家人的喜愛(ài)。但廣東客家娘酒中存在著有害物質(zhì)氨基甲酸乙酯（EC）[1]，它是一種2A級(jí)的致癌物[2]，對(duì)人體健康有著潛在危害，俗話說(shuō)食以安為先，可見(jiàn)控制黃酒中EC的含量，對(duì)黃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義[3]。

1 氨基甲酸乙酯介紹及其致癌性

氨基甲酸乙酯，簡(jiǎn)稱(chēng)EC，是一種無(wú)色的結(jié)晶[4]，易溶于水、乙醇、乙醚等[5]，結(jié)構(gòu)如下：

在很多發(fā)酵食品中酒類(lèi)、醬油等中EC都存在[6]。關(guān)于EC的致癌性很早就有研究了[7]。

1.1 EC的致癌機(jī)理

很多研究學(xué)者都關(guān)注并探究了EC的致癌機(jī)理[8]。EC很容易被人體吸收，會(huì)引起皮膚癌、肝癌等，因此對(duì)人體健康不利。EC在生物體內(nèi)基本上是在肝內(nèi)發(fā)生分解代謝或是以尿的形式排出，但仍然有微量的EC能被氧化為一種環(huán)氧化物，此環(huán)氧化物會(huì)在體內(nèi)形成DNA的加聚物，破壞生物體DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致代謝的細(xì)胞癌變；或是EC被細(xì)胞色素氧化為N-羥基-氨基甲酸乙酯，此物質(zhì)通過(guò)誘導(dǎo)Cu2+調(diào)控而導(dǎo)致DNA損傷[9]。

1.2 EC的生成機(jī)理

相關(guān)研究表明，EC的生成機(jī)理與黃酒的發(fā)酵原理相關(guān)，不同的發(fā)酵方式產(chǎn)生不同的機(jī)理[10]，在黃酒中EC的生成最主要的是尿素與乙醇反應(yīng)[11]，其次是氨甲酰磷酸與乙醇反應(yīng)、瓜氨酸與乙醇反應(yīng)。相關(guān)學(xué)者證實(shí)了黃酒中EC的產(chǎn)生基本上都是由乙醇和尿素反應(yīng)生成的，在黃酒的釀造過(guò)程中，原輔料帶入或是在發(fā)酵過(guò)程中酵母菌代謝產(chǎn)生的尿素都會(huì)造成尿素的積累[12]。

2 氨基甲酸乙酯的檢測(cè)方法

EC的檢測(cè)方法比較多，從早期開(kāi)始就有研究，不過(guò)研究方法并不成熟，只能定性檢測(cè)，隨著儀器的發(fā)展，EC的檢測(cè)方法也越來(lái)越完善，目前關(guān)于EC的檢測(cè)使用較多的方法是氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[13]。

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法在早期應(yīng)用廣泛，多用于氣體、易揮發(fā)的液體和某些固體的分析中[14]，而且靈敏度高，可用于測(cè)定痕量物質(zhì)，一般mg級(jí)的都能檢測(cè)到，分析速度快，一般在1 h內(nèi)就能完成一次分析，且操作迅速又簡(jiǎn)單。但氣相色譜法難以定性，且只能用于復(fù)雜組分的檢測(cè)，若沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖對(duì)照，則很難判定某出峰時(shí)間的色譜峰代表什么物質(zhì)。

2.2 氣質(zhì)聯(lián)用法

GC-MS在氣相色譜法的基礎(chǔ)上能快速高效地對(duì)樣品進(jìn)行定量和定性分析[15]。特別適用于復(fù)雜混合物中某組分的鑒定[16]。一般黃酒中的EC檢測(cè)采用此法，劉俊等人[17]使用氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定了黃酒中微量EC的含量。研究表明，此方法線性相關(guān)系數(shù)0.993 9，回收率為94.65%。

樣品的GC-MC萃取前處理一般采用液液萃取、固相萃取或頂空固相微萃取等方法將EC提取出來(lái)，再進(jìn)行下一步操作。

（1）液液萃取。液液萃取是早期常用的一種樣品前處理方法，利用了溶解度差異來(lái)分離組分，一般需使用大量的有機(jī)溶劑才能達(dá)到目的。對(duì)于萃取EC的很多試劑都具有一定的毒性，早期一些學(xué)者使用三氯甲烷、無(wú)水乙醚等，但由于毒性很強(qiáng)，對(duì)人體健康有危害，后來(lái)采用CH2Cl2作為溶劑去提取EC，提取效果好，且毒性相對(duì)較低，同時(shí)對(duì)環(huán)境的危害小。林超等人[18]采用液液萃取結(jié)合GC-MS內(nèi)標(biāo)法測(cè)定葡萄酒中EC的含量，以氨基甲酸丙酯為內(nèi)標(biāo)物，探究了KC 1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、CH2Cl2的用量、待測(cè)溶液的pH值等因素對(duì)EC萃取率的影響，得出在樣品pH值保持不變的情況下，KC 1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%，CH2Cl2用量為300 mL時(shí)，方法的檢出限為8 μg/L，回收率為90.7%～106.3%。

（2）固相萃取。萃取柱內(nèi)的吸附劑吸附樣品中的目標(biāo)成分，而其他成分則通過(guò)其他試劑洗脫下來(lái)，達(dá)到樣品分離純化的目的。李鳳華等人[19]將樣品經(jīng)硅藻土固相萃取柱凈化，后采用乙醚洗脫，得出EC在10～160 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢出濃度為4 g/L，回收率為93.3%～111.8%。與早期的LLE樣品前處理方法相比，SPE方法所需的萃取試劑大大減少了，而且萃取率更好。

（3）固液萃取。固液萃取，也叫浸提，使固體樣品中可溶性成分溶解于溶劑中而加以分離的方法。項(xiàng)東方等人[20]將樣品和硅藻土混合均勾，裝入玻璃色譜層析柱中，然后用萃取溶劑洗脫得出EC的檢出限為2.0 μg/L，回收率91.0%～102.0%。此方法與固相萃取相似，具有較高的準(zhǔn)確度，萃取柱需要自己制作，不過(guò)這樣精密度也更高些。

（4）固相微萃取。固相微萃取一般是將固相微萃取頭纖維暴露于密封的樣品瓶的頂空中，樣品經(jīng)過(guò)加熱后，其中的揮發(fā)性氣體部分進(jìn)入氣相色譜儀分析的方法[21]。劉俊[22]采用固相微萃取萃取EC，丙酸辛酯為內(nèi)標(biāo)物，將樣品置于50℃條件下進(jìn)行預(yù)熱，5 min后進(jìn)行萃取45 min，最后解析5 min，黃酒中EC含量能最大程度地降低。這種方法極為簡(jiǎn)化、分析速度快，避免了高沸點(diǎn)物或非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)分析柱造成超載和污染問(wèn)題。

2.3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

對(duì)于分析復(fù)雜樣品中的微量EC時(shí)，GC-MS法也有一定的局限性，因?yàn)橐话銟悠方?jīng)過(guò)前處理后，其所含的EC或多或少都會(huì)減少，對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。有研究者探究過(guò)GC-MS和GC-MS-MS對(duì)酒的測(cè)定比較，發(fā)現(xiàn)GC-MS-MS法可以除去GC-MS法中的干擾峰，且可以省去樣品前處理的步驟，更加靈敏、快速。

2.4 液質(zhì)色譜法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS） 能用于熱穩(wěn)定性差、難揮發(fā)的大分子有機(jī)化合物的檢測(cè)，此方法發(fā)展時(shí)間不長(zhǎng)，對(duì)樣品的檢測(cè)有著高選擇性，在酒類(lèi)檢測(cè)中使用的較少，多用于醬油生產(chǎn)中。

3 吸附氨基甲酸乙酯的材料探究

研究表明，黃酒中EC的直接減除與多種材料有關(guān)，如活性炭、硅膠、硅藻土、殼聚糖、PVPP等，其中活性炭與殼聚糖的吸附效果較好，但用活性炭吸附后對(duì)黃酒的感官影響也較大，吸附后酒變?yōu)闇\黃色，且酒味較淡；使用殼聚糖吸附對(duì)酒體的風(fēng)味影響不大，但殼聚糖溶解度差，且價(jià)格較高；硅膠、硅藻土和PVPP這3種材料吸附效果基本一致，且較低，其中用硅藻土吸附黃酒中的EC后酒體風(fēng)味也能最大程度地保持，故在黃酒中使用較多，且符合經(jīng)濟(jì)效益。

硅藻土的主要成分是二氧化硅，輕質(zhì)多孔、比表面積大、化學(xué)穩(wěn)定性高，之所以具有吸附性能主要原因是硅藻土的殼壁由非晶質(zhì)二氧化硅構(gòu)成，殼壁表面具有特殊的微孔結(jié)構(gòu)，這些小孔能均勻吸附各種有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)。運(yùn)用于食品行業(yè)作為助濾劑是優(yōu)質(zhì)硅藻土的主要用途之一，我國(guó)飲料產(chǎn)業(yè)中硅藻土的用量達(dá)到其產(chǎn)量的2/3。此外，硅藻土還可以用于吸附凈化等產(chǎn)業(yè)，可用于吸附各種金屬離子、有機(jī)化合物和高分子聚合物等。這主要是由于其表面羥基結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性。硅藻土表面羥基結(jié)構(gòu)使其顆粒表面帶負(fù)電荷，在水溶液中呈弱酸性，因此可用于吸附陽(yáng)離子。我國(guó)硅藻土礦產(chǎn)資源豐富，價(jià)格低廉，應(yīng)用潛力巨大。但是硅藻土產(chǎn)地不同，吸附性能差異很大，且天然硅藻土往往因雜質(zhì)含量較高，而使得其應(yīng)用在許多方面受到限制。這主要是由于雜質(zhì)會(huì)造成微孔堵塞，且會(huì)占據(jù)硅藻土吸附點(diǎn)位，從而造成硅藻土吸附效果的降低。因此，需要通過(guò)提純改性等手段進(jìn)一步提高其吸附性能。隨著技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多性能優(yōu)良的新型吸附性高分子材料被合成，并在許多行業(yè)中廣泛應(yīng)用。在黃酒產(chǎn)業(yè)中硅藻土的改性已經(jīng)較為普遍，仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院白衛(wèi)東經(jīng)過(guò)研究堿浸硅藻土對(duì)黃酒中EC的去除，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)堿處理后的硅藻土其去除率提升很高，且處理后酒體的風(fēng)味與原酒基本一致。

為了能在客家黃酒工廠化生產(chǎn)中，用更好的吸附技術(shù)去除氨基甲酸乙酯，試驗(yàn)對(duì)比分析5種吸附材料，從中挑選出最優(yōu)改性材料和對(duì)應(yīng)的最優(yōu)單因素組合預(yù)處理方案。結(jié)果表明，5種原始吸附材料對(duì)廣東客家黃酒中氨基甲酸乙酯的去除率依次為硅藻土33.24%，殼聚糖60.89%，交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮24.30%，活性炭52.33%，硅膠25.43%。綜合以上結(jié)果得出殼聚糖的吸附效果最好，但價(jià)格較高，硅藻土綜合有優(yōu)勢(shì)，故探究了關(guān)于硅藻土不同的改性方法，利用堿法改性硅藻土和殼聚糖改性硅藻土，探索其最適改性條件。利用單因素優(yōu)化試驗(yàn)，從時(shí)間、溫度、用量3個(gè)單因素出發(fā)，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)一步優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)堿法改性過(guò)的硅藻土加入到黃酒中，吸附去除EC的最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間13 h，硅藻土添加量1%。通過(guò)試驗(yàn)所得的改性硅藻土在最優(yōu)處理?xiàng)l件下，氨基甲酸乙酯去除率最大可達(dá)78.92%，而未經(jīng)改性的硅藻土對(duì)EC的去除率僅為34.53%。而用殼聚糖改性硅藻土后，加入黃酒中進(jìn)行吸附，經(jīng)試驗(yàn)篩所得改性硅藻土，吸附效果為原硅藻土的2.24倍，此次試驗(yàn)所得改性硅藻土材料對(duì)黃酒中EC的吸附去除的最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間11 h，硅藻土添加量1.2%，得到最佳去除效果為74.74%。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)食品安全的關(guān)注度越來(lái)越高，黃酒中的EC去除一直是個(gè)亟待解決的問(wèn)題，而且黃酒在國(guó)際上的關(guān)注也較高，特別是中國(guó)黃酒在日本、東南亞有廣泛市場(chǎng)，深受當(dāng)?shù)厝藗兿矏?ài)，因此解決EC問(wèn)題的需求也越來(lái)越緊迫，應(yīng)積極采取有效措施，控制黃酒中的EC含量，維護(hù)黃酒消費(fèi)市場(chǎng)穩(wěn)定，盡早為我國(guó)黃酒生產(chǎn)消除隱患。