雙孢蘑菇酶解液的制備及GC-MS分析

程艷芬，井衛(wèi)青，馮翠萍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中 030801）

國(guó)內(nèi)外研究表明，酶法水解可以改善食品的營(yíng)養(yǎng)吸收特性及風(fēng)味[1-3]。目前，食用菌酶法水解的研究多集中在蛋白質(zhì)、多糖、黃酮和水溶性膳食纖維的提取及抗氧化等功能性質(zhì)和相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)方面[4-7]，對(duì)酶法水解后食藥用菌的風(fēng)味特征和揮發(fā)性成分研究較少。雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）因其風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富而在全球范圍均有種植和消費(fèi)[8]，在加工過(guò)程中風(fēng)味會(huì)迅速改變。熱加工過(guò)程中，雙孢蘑菇中醇的含量顯著降低，而酮和酸的含量則明顯增加[9]。單純煮沸的雙孢蘑菇湯中揮發(fā)性成分的數(shù)量顯著高于煮沸加蒸壓蘑菇湯中的揮發(fā)性成分[10]。冷凍干燥、熱風(fēng)干燥和微波真空干燥的加工方式對(duì)雙孢蘑菇的揮發(fā)性成分的影響與熱加工方式一致。雙孢蘑菇子實(shí)體酶解液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究較少。

為探討新鮮的雙孢蘑菇子實(shí)體酶解液中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，試驗(yàn)采用堿性蛋白酶（Alkaline protease）、纖維素酶（Cellulase）、堿性蛋白酶復(fù)合纖維素酶對(duì)新鮮雙孢蘑菇子實(shí)體進(jìn)行水解。設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)考查溫度（A）、pH值（B）、酶添加量（C）和時(shí)間（D） 對(duì)雙孢蘑菇蛋白水解度（DH） 的影響。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS） 對(duì)雙孢蘑菇蛋白水解度最高的酶解液中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。為研究雙孢菇酶解后特有風(fēng)味的形成機(jī)理和功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雙孢蘑菇，山西鼎昌農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 雙孢蘑菇預(yù)處理

選擇新鮮白色、沒(méi)有腐爛變質(zhì)和嚴(yán)重褐變的雙孢蘑菇，切塊，浸于護(hù)色液（0.6%檸檬酸+0.3%氯化鈉+0.05%抗壞血酸） 中約30 min。料液比為1∶2，勻漿機(jī)打漿備用。

1.2.2 Cellulase水解雙孢蘑菇參數(shù)的篩選

Cellulase正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Cellulase正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

按照表1所列的四因素三水平對(duì)雙孢蘑菇處理，處理完成后將雙孢蘑菇樣液取出，加入50 mL蒸餾水，搖勻后緩緩加入Zn（CH3COO）2溶液5 mL和K4Fe（CN）6·3H2O 溶液 5 mL，然后定容至 100 mL，靜置，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，取上清液。計(jì)算還原糖的含量[11]。

1.2.3 Alkaline protease酶解雙孢蘑菇參數(shù)的篩選

Alkaline protease正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 Alkaline protease正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

按照表2所示對(duì)雙孢蘑菇處理，處理完成后，記錄室溫下恢復(fù)至原始pH值所消耗0.1 mol/LNaOH的體積，并計(jì)算DH[12]。

1.2.4 Alkaline protease復(fù)合Cellulase對(duì)雙孢蘑菇的酶解

在上述1.2.3測(cè)得的條件下，先用Alkaline protease水解雙孢蘑菇子實(shí)體，再在1.2.2測(cè)得的條件下，用Cellulase水解，測(cè)定最終酶解液的DH。與1.2.3測(cè)得的DH相比，取DH大的酶解產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.5 GC-MS試驗(yàn)條件

根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行試驗(yàn)條件的設(shè)置，對(duì)部分條件進(jìn)一步改進(jìn)：色譜柱為DMNI-MS型毛細(xì)管柱（30 m×250 μm 0.25 μm）；柱溫 45 ℃，保持 2 min，以6℃/min上升至240℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度270℃，流速1 mL/min，無(wú)分流。離子源溫度280℃，掃描質(zhì)量范圍35～600。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cellulase水解雙孢蘑菇最佳參數(shù)的確定

Cellulase水解雙孢蘑菇的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，還原糖含量最高的組合為A2B2C3D1，各個(gè)因素對(duì)雙孢蘑菇酶解后還原糖含量的影響依次為B＞C＞D＞A。測(cè)得各因素的最優(yōu)水平組合A1B2C3D2條件下，雙孢菇的酶解液中還原糖含量為2.04%，高于A2B2C3D1。因此，Cellulase水解雙孢菇的最佳參數(shù)確定為A1B2C3D2，即酶解溫度50℃，pH值5.0，酶添加量0.8%，時(shí)間120 min。

表3 Cellulase水解雙孢蘑菇的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 Alkaline proteas水解雙孢蘑菇最佳參數(shù)確定

研究表明，以DH作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，Alkaline proteas是從5種不同的蛋白酶中篩選出來(lái)的水解雙孢蘑菇的最佳蛋白酶[14]，因此選用Alkaline proteas。

Alkaline protease酶解雙孢蘑菇的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Alkaline protease酶解雙孢蘑菇的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，DH最高的處理組合為A'2B'3C'1D'3，各因素對(duì)雙孢蘑菇的水解液中DH的影響依次為B'＞C'＞D'＞A'。測(cè)得因素的最優(yōu)水平組合 A'2B'3C'2D'3條件下雙孢蘑菇酶解液DH均值為18.27%，高于A'2B'3C'1D'3。因此，最佳方案確定為溫度40℃，pH值10.5，酶添加量0.9%，時(shí)間150 min。

2.3 Alkaline proteas復(fù)合Cellulase水解雙孢蘑菇結(jié)果

在上述篩選出的最佳條件下，用Alkaline proteas復(fù)合Cellulase酶解雙孢蘑菇，做3次重復(fù)，測(cè)得DH分別為21.30%，20.98%，20.12%。將該結(jié)果與雙孢蘑菇Alkaline proteas酶解液的DH進(jìn)行方差分析。方差分析見(jiàn)表5。

表5 方差分析

由表5可知，F(xiàn)值為31.5，大于方差分析表中F0.05（1，4）=7.71，F(xiàn)0.01（1，4）=21.20，差異極顯著。因此，選擇雙孢蘑菇復(fù)合酶水解雙孢蘑菇的酶解液進(jìn)行GC-MS分析。

2.4 雙孢蘑菇酶解產(chǎn)物揮發(fā)性成分的GC-MS分析

雙孢菇酶解產(chǎn)物揮發(fā)性成分的GC-MS見(jiàn)圖1，雙孢蘑菇酶解產(chǎn)物揮發(fā)性化合物組成及其含量見(jiàn)表6，酶解后的雙孢蘑菇中揮發(fā)性化合物的種類(lèi)及相對(duì)含量見(jiàn)表7。

圖1 雙孢菇酶解產(chǎn)物揮發(fā)性成分的GC-MS

表6 雙孢蘑菇酶解產(chǎn)物揮發(fā)性化合物組成及其含量

表7 酶解后的雙孢蘑菇中揮發(fā)性化合物的種類(lèi)及相對(duì)含量

通過(guò)GC-MS測(cè)得雙孢蘑菇水解產(chǎn)物中的揮發(fā)性成分33種，總的相對(duì)含量為77.81%，其組成和含量列于表6中，其中的1-辛烯-3-醇的相對(duì)含量最高為33.37%，其次為芐醇13.67%，苯甲醛11.38%，3-辛酮4.91%，均為C8類(lèi)化合物，結(jié)果與其他食用菌香味的報(bào)道一致。不管是新鮮雙孢菇，還是煮沸、干燥或水解后的雙孢菇，C8化合物對(duì)其鮮味影響最大。將表6中的化合物進(jìn)行分類(lèi)整理，結(jié)果如表7所示，雙孢蘑菇酶解液中醛類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)最多，有10種，相對(duì)含量為20.50%；醇類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)有8種，但其相對(duì)含量為49.86%，最高。其次為酮類(lèi)物質(zhì)，共6種。還含有少量的烷烴、烯烴、苯類(lèi)、含氮化合物等。此外，酶解后的雙孢蘑菇中還含有2種吡嗪類(lèi)化合物，相對(duì)含量0.27%，與美拉德反應(yīng)有關(guān)，熱加工和干燥處理沒(méi)有檢測(cè)到該物質(zhì)。酶解后，醛酮類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)增加，酯類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)減少可能是由于新鮮雙孢菇子實(shí)體中的酸類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)在酶解條件下降解成醛酮類(lèi)物質(zhì)。

3 結(jié)論

纖維素酶水解雙孢菇子實(shí)體的最佳參數(shù)為溫度50℃，pH值5.0，酶添加量0.8%，時(shí)間120 min；堿性蛋白酶水解雙孢菇子實(shí)體的最佳條件為溫度40℃，pH值10.5，酶添加量0.9%，時(shí)間150 min。用復(fù)合酶水解雙孢菇子實(shí)體后，DH為20.80%，其中有33種揮發(fā)性化合物。