Mitf-M基因突變對豬耳蝸血管紋發(fā)育的影響

陳林軍 邱士偉 龍熙 陳磊 唐朝穎 塞娜 郭維維 楊仕明 韓維舉

1中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科聾病教育部重點實驗室聾病防治北京市重點實驗室軍事聲損傷防護實驗室（北京100853）

2重慶市畜牧科學院（重慶402460）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，目前約有5%的患者有不同形式的聽力下降，而大部分是感音神經(jīng)性耳聾[1]，在新生兒中約占1/1000[2]，而其中極重度感音神經(jīng)性耳聾占2%[3]，大部分為遺傳性耳聾包括Waardenburg綜合征。根據(jù)臨床表現(xiàn)可將Waardenburg綜合征分為4型[3,4]，而其中由Mitf基因突變引起的為Waardenburg綜合征2A型，表現(xiàn)為重度感音神經(jīng)性耳聾、虹膜異色、白色眼圈等。Mitf是小眼球畸形相關轉錄因子[2]，是胚胎期參與調(diào)控黑色素細胞游走的重要因子，在耳蝸中主要調(diào)節(jié)血管紋中間細胞的生長發(fā)育。既往對于Mitf基因突變引起血管紋的變化在小鼠和豬上有報道[5-10]，認為Mitf基因突變能引起血管紋中間細胞的減少，從而影響血管紋離子轉運功能導致耳蝸內(nèi)電位的降低而引起耳聾，但對血管紋其他結構的影響并沒有進一步的報道。

本研究利用Mitf-M基因突變型豬對耳蝸血管紋的變化進行觀察，研究Mitf-M突變型豬是否還出現(xiàn)血管紋毛細血管、血管紋邊緣細胞的變化，從而進一步闡述Mitf-M基因突變引起耳蝸功能障礙的致病機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

野生型和Mitf-M突變型豬各12頭（由重慶畜牧科學院提供），雌雄不限，飼養(yǎng)環(huán)境溫濕度適宜，該研究方案得到重慶畜牧科學院動物倫理委員會的批準。

1.2 取材及免疫熒光

取出生后 7d、10d、30d、40d日齡的野生型和Mitf-M突變型豬各2頭，用0.1ml/kg速眠新（長春獸醫(yī)大學軍需研究所）以及2%的戊巴比妥鈉（北京華業(yè)寰宇化工有限公司）1ml/kg肌肉注射麻醉，待動物進入深度麻醉狀態(tài)（角膜反射減弱或消失，無自主肌肉運動）后，立即斷頸處死。取出耳蝸，置于4%多聚甲醛溶液中。撕破圓窗膜、卵圓窗膜，蝸尖鉆孔，將標本放于4%多聚甲醛溶液中，于4℃冰箱中過夜。

耳蝸切片：耳蝸標本經(jīng)固定后，快速分離耳蝸骨壁，取出外側壁（即螺旋韌帶和血管紋），分別放入20%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液梯度脫水各2h后，置于灌滿OTC膠（SAKURA，日本）的包埋盒中，標記好外側壁位置，置于-20℃冷凍2h。使用冰凍切片機（Leica CM1900，德國）沿外側壁長軸切片，厚度選擇10μm，切片直接貼于多聚賴氨酸載玻片上。每次兩種豬的切片各取2張，PBS沖洗三次，每次5min；0.1%Triton溶液30min，加5%羊血清封閉，置于37℃下作用30min，PBS沖洗三次，每次5min；加入200微升PBS液；4℃冰箱過夜，PBS沖洗三次，每次5min，將標本移入1:200稀釋的GS-IB4中（Invitrogen，美國），避光常溫孵育60min，PBS清洗后，甩干載玻片，SZX10解剖顯微鏡（Olympus,日本）下使用含DAPI（ZLI-9557，中衫金橋）熒光染料的甘油封片。應用LSM800型號激光共聚焦顯微鏡（蔡司，德國）觀察血管紋、螺旋韌帶結構。

耳蝸鋪片：耳蝸標本，經(jīng)快速分離耳蝸外側壁，將其分離為若干段。PBS沖洗三次，每次5min；0.1%Triton溶液60min，加5%羊血清封閉，置于37℃下作用60min，PBS沖洗三次，每次5min，后移入1:300稀釋的Phalloidin溶液中（ab176756，美國），常溫避光孵育60min，PBS清洗后，解剖顯微鏡下鋪片，并使用含DAPI熒光染料的甘油封片。應用激光共聚焦顯微鏡觀察血管紋結構。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有的標本經(jīng)免疫熒光染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察，在63倍鏡下對不同組別不同時間段的耳蝸底回血管紋進行觀察。每組每個耳蝸隨機選取3張外側壁切片，對其血管紋毛細血管進行計數(shù)取均值；每組每個耳蝸鋪片取三個20μm*20μm的視野進行邊緣細胞的計數(shù)取均值[16]。

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，使用SPSS22軟件進行統(tǒng)計學分析。采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05具有顯著統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 比較野生型豬與Mitf-M突變型豬的耳蝸外側壁血管紋毛細血管的變化。

圖1 出生后7d與40d的野生型和Mitf-M突變型豬耳蝸的切片，其中1a、1b、1c為野生型豬，1d、1e、1f為Mitf-M突變型豬。1a為7d的野生型豬10X鏡下的耳蝸切片圖，1b為其對應的63X鏡下的圖，1c為40d的外側壁圖；1d為7d的Mitf-M突變型豬10X鏡下的耳蝸切片圖，1e為7d的63X鏡下的圖，1f為40d的圖。Dapi（藍色）標記細胞核，GS-IB4（紫色）標記毛細血管內(nèi)皮細胞。圖中箭頭所指為血管紋的毛細血管。標尺為100μm。Fig.1 sections of the cochlea of wild type and Mitf-M mutant swines at P7,P40.1a,1b,1c are wild type swines,and 1d,1e,1f are Mitf-M mutant swines.1a is cochlear slice of the wild type under 10X microscope at P7,1b is the corresponding lateral wall under 63X microscope,1c is the lateral wall at P40;1d is the cochlear section of the Mitf-M mutant swine at P7 under 10X microscope,1e is the corresponding lateral wall under 63X microscope,and 1f is the lateral wall at P40.Dapi(blue)labels nuclei,GS-IB4(purple)labels capillary endothelial cells.The arrows in the figure refer to the stria capillaries.The scaler is 100 μm.

應用激光共聚焦顯微鏡對出生后7d、10d、30d、40d的外側壁標本進行切片觀察，在63倍激光共聚焦顯微鏡下對耳蝸標本進行層掃，掃描結果如圖1所示。經(jīng)過統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)在出生后7d、10d及30d，血管紋毛細血管密度沒有明顯差異，無統(tǒng)計學意義。而在40d的Mitf-M突變型豬的血管紋毛細血管數(shù)量出現(xiàn)明顯減少，P值=0.005，P值＜0.05，有統(tǒng)計學意義（如圖2所示）。

圖2 血管紋毛細血管密度對比Fig.2 the comparison of stria capillary density

2.2 觀察Mitf-M突變型與野生型豬的血管紋邊緣細胞形態(tài)及數(shù)量。

圖3 出生后7d與40d的豬的耳蝸血管紋鋪片。3a為7d的野生型豬的血管紋鋪片，可見邊緣細胞形態(tài)規(guī)則，大小一致，排列緊密，細胞核完整，細胞骨架整齊；3b為7d的Mitf-M突變型豬的血管紋鋪片，其邊緣細胞形態(tài)規(guī)則，排列緊密，細胞核完整，細胞骨架整齊，未見破壞。3c為40d的野生型豬的血管紋鋪片，結果與3a相近；3d為40d的Mitf-M突變型豬的血管紋鋪片，結果類似于3b。Phalloidin（黃色）標記細胞骨架，Dapi（藍色）標記細胞核。標尺為20μm。Fig.3 the cochlear stria pattern of the swines at P7,P40.3a is the stria pattern of the wild type swines at P7,the shape of the marginal cells is regular,closely arranged,and the size is similar,the marginal nuclei is intact and the cytoskeleton is well-arranged;3b is the stria pattern of Mitf-M mutant swine at P7,the shape of the marginal cells is regular,closely arranged,and the size is similar,the marginal nuclei is intact,the cytoskeleton is neat and without any damage.3c is the stria pattern of the wild type swines at P40,its result is like 3a.3d is the stria pattern of the Mitf-M mutant swines at P40,the result is similar with 3b.Phalloidin(yellow)marks the cytoskeleton and Dapi(blue)marks the nucleus.The ruler is 20μm.

應用激光共聚焦顯微鏡對出生后7d、40d的外側壁標本進行鋪片觀察，在63倍鏡下對耳蝸標本進行層掃可見血管紋邊緣細胞形態(tài)規(guī)則，大小一致，排列緊密，細胞核完整，細胞骨架整齊，如圖3所示。我們發(fā)現(xiàn)在出生后7d、40d的Mitf-M突變型豬的血管紋邊緣細胞骨架完整，無明顯破壞。經(jīng)過統(tǒng)計得出在出生后7d、40d的Mitf-M突變型豬相對野生型豬的邊緣細胞數(shù)量沒有差異，P=0.184，P值＞0.05，無統(tǒng)計學意義（如圖4所示）。

圖4 血管紋邊緣細胞數(shù)的對比Fig.4 the comparison of the number of stria marginal cells

3 討論

耳蝸外側壁是由螺旋韌帶和血管紋所組成，而血管紋是高度血管化的組織[11,12]，由直接接觸內(nèi)淋巴液的邊緣細胞、緊鄰螺旋韌帶的基底細胞及介于兩者間的中間細胞和毛細血管網(wǎng)等組成，在調(diào)節(jié)耳蝸內(nèi)電位的穩(wěn)定及離子轉運循環(huán)中發(fā)揮重要作用[13]，且對于聽覺感覺上皮細胞的存活異常重要。

國外Liu[8]等研究報道由于Mitf突變小鼠可出現(xiàn)血管紋的異常，表現(xiàn)為中間細胞的消失及耳蝸內(nèi)電位的降低，但未進一步觀察血管紋邊緣細胞、毛細血管網(wǎng)的變化。結合前期Chen等研究報道[10]，Mitf-M型基因突變型豬伴有極重度感音神經(jīng)性耳聾，檢查發(fā)現(xiàn)其內(nèi)耳鉀離子濃度極度減低及耳蝸內(nèi)電位基本消失，推測由于血管紋中間細胞的受損而破壞了耳蝸內(nèi)電位穩(wěn)態(tài)。根據(jù)國外Wangemann[14]研究SLC26A4-/-突變小鼠，由于中間細胞缺乏KCNJ10蛋白，而導致耳蝸內(nèi)電位的喪失及邊緣細胞骨架的坍塌。在我們的研究中通過標記中間細胞的蛋白S100顯著減少（該部分數(shù)據(jù)有待發(fā)表），證實Mitf-M突變型豬雖在出生后血管紋中間細胞減少，但并未影響血管紋邊緣細胞骨架及邊緣細胞數(shù)量的變化，且在出生后早期血管紋毛細血管沒有明顯變化，而從40d開始出現(xiàn)血管紋毛細血管網(wǎng)明顯的減少。我們研究表明Mitf-M基因突變引起的血管紋損傷明顯不同于SLC26A4-/-突變引起的血管紋的病變。

國外Ingham[15]研究在同樣引起EP下降的S1PR2突變小鼠中，從出生后28d開始出現(xiàn)血管紋邊緣細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞核大小不一，EP逐漸下降至40mV，且血管紋毛細血管變寬；到P56出現(xiàn)邊緣細胞骨架疏松、破壞及血管紋毛細血管腫脹破壞。但在我們實驗中發(fā)現(xiàn)Mitf-M基因突變并沒有引起血管紋邊緣細胞骨架的破壞以及血管紋毛細血管腫脹、破壞的現(xiàn)象。對比國外Ohlemiller[16]利用血管紋中間細胞失去分泌黑色素的功能C57BL/6-Tyrc-2J突變小鼠，在24個月后才發(fā)現(xiàn)血管紋其厚度變薄，邊緣細胞數(shù)量輕度的減少，但只出現(xiàn)耳蝸內(nèi)電位的輕度下降?？紤]Tyr作為Mitf[2,17,18]的下游基因，只針對性地影響血管紋中間細胞失去分泌黑色素的作用，而不破壞血管紋調(diào)控內(nèi)淋巴平衡的功能。但在我們的Mitf-M基因突變型豬中發(fā)現(xiàn)Mitf-M基因突變導致血管紋厚度的變薄，且耳蝸內(nèi)電位基本消失，而在早期并沒有出現(xiàn)血管紋邊緣細胞數(shù)量的減少及細胞骨架的破壞，這也讓我們進一步明確Waardenburg綜合征2A型的病變機制。在發(fā)病早期，血管紋由于中間細胞的減少而引起的耳蝸內(nèi)電位的喪失，但并沒有出現(xiàn)血管紋邊緣細胞及血管紋毛細血管密度的減少，這也為下一步的基因編輯治療提供明確的救治時間窗。

前期陳偉[19,20]報道發(fā)現(xiàn)豬的內(nèi)耳和人類相比在功能和形態(tài)上極大的相似性，且已建立成熟的內(nèi)耳手術入路方式。任麗麗等[21]利用從出生前后不同發(fā)育階段的野生型榮昌豬及Mitf-M突變型豬的內(nèi)耳形態(tài)學和聽功能的檢查比較分析，得出Mitf-M突變型豬的內(nèi)耳鉀離子濃度和耳蝸內(nèi)電位消失，聽功能完全喪失。同時Chen[7]已對突變耳聾豬進行系統(tǒng)的基因分析，明確致病基因為Mitf-M基因突變。即為我們提供了人類Waardenburg綜合征2A型的天然大型哺乳動物模型，這也為以后實現(xiàn)基因編輯治療提供了極佳的臨床試驗對象。目前基于Cas9的基因治療已在遺傳性耳聾的小鼠中實現(xiàn)聽力的部分改善[22,23]，而基因編輯技術想應用于治療人類遺傳性疾病的過程中，正缺少合適的大型哺乳動物模型，而該Mitf-M突變型豬正是當前模擬人類疾病進行基因編輯治療的最佳的動物模型。本研究明確Mitf-M基因突變導致的內(nèi)耳血管紋等結構的破壞，為實現(xiàn)在該模型中應用基因編輯技術提供了重要的理論基礎。